2. Materiaal en Methoden

2.1 Kweek

2.1.1 Celkweek

2.1.1.1 L-929 cellijn

De L-929 cellijn is een fibroblastcellijn die men in Rouxflessen laat groeien totdat men een monolaag bekomt. Het is een continue cellijn die afkomstig is van normaal subcutaan areolair en adipeus weefsel van een 100 dagen oude mannelijke (C3H/An) muis [54]. De cellen worden gecultiveerd in MEM (Invitrogen Corporation) (zie bijlage A.1) aangerijkt met 10% paardenserum in de incubator op 37^C bij een 5% $CO_2$-druk. De cellen werden oorspronkelijk aangekocht bij het American Type Culture Collection (ATCC).

Omdat zich op een bepaald moment een probleem van bacteriële contaminatie voordeed, werd er beslist om 2 nieuwe antimicrobiële stoffen toe te voegen aan het celmedium. De eindconcentratie van deze antimicrobiële stoffen in het medium bedroeg 0.54 mM gentamycine (Invitrogen Corporation) en 2,7 $\mu$M Fungizone$^{\circledR}$ of amphotericine B (Invitrogen Corporation).

Gentamycine is een aminoglycoside dat vooral micromonospora en pseudomonas aeroginosa aantast. Dit gebeurt door een irreversiebele inhibitie van de proteïnensynthese. Resistentie kan verworven worden als er extrachromosomaal gecontroleerde enzymen aanwezig zijn (de R-factoren) die het antibiotica inactiveren door het te fosforyleren, te acetyleren of door er een adenylatie op uit te voeren [11].

Fungizone$^{\circledR}$ of amphotericine B bindt op sterolen (ergosterol) aanwezig in de celmembraan van sommige fungi, algen, protozoa en dierlijke cellen. De binding zorgt voor een stijging van de membraanpermeabiliteit, zodat essentiële componenten (bv. natrium) naar het extracellulair milieu lekken [11].

2.1.2 Cellen tellen

Om te weten hoeveel virus we moeten toevoegen om de cellen te infecteren met 10 p.f.u. (zie sectie 2.2) per cel, moet het aantal cellen gekend zijn. Daarvoor nemen we een petrischaal met cellen en voegen aan deze schaal 2 ml trypsine toe. Deze (verdunnings)factor wordt in rekening gebracht, net als een factor die eigen is aan de Bürkerkamer (= 5000). We tellen het aantal cellen in de Bürkerkamer binnen 50 vierkantjes m.b.v. een telapparaatje. Dit getal zal dienen als referentie voor de rest van de populatie. We bekomen dan bijvoorbeeld: 227 cellen x 2 ml trypsine x 5000 = 2 270 000 cellen. Omdat de titer van het virus bekend is en de cellen geïnfecteerd worden aan bv. 10 p.f.u./cel, weten we hoeveel microliter virussuspensie we per petrischaal moeten toevoegen. We infecteren aan 10 p.f.u./cel omdat de cellen dan vanaf het begin allemaal geïnfecteerd raken.

2.1.3 Virus

Voor onze experimenten gebruiken we de DA-stam van het TMEV (zie sectie 1.2). Deze demyeliniserende stam van het TMEV werd bekomen bij Prof. Dr. T. Michiels (UCL). De L-cel is een uitstekende waardcel voor dit virus.

2.1.4 Viruskweek

Voor een viruskweek gebruiken we ongeveer 20 Rouxflessen (150 c$m^2$) met L-cellen waarvan het medium werd afgegoten. De cellen werden nagespoeld met een weinig medium of trisbuffer (bijlage A.2). Hierop kweken we de DA-stam van het TMEV door 2 ml P3- materiaal (P = passages) per Rouxfles op de cellen te brengen en 1 uur te laten adsorberen. We kantelen de Rouxflessen elke 15 minuten. Tenslotte voegen we overal 15 ml medium, dat 1% paardenserum bevat, toe.

Na het optreden van het cytopathogeen effect (= morfologische veranderingen die de cel ondergaat bij virale infectie zoals marginatie van het chromatine, membraanvesikels in het cytoplasma, membraanlekken,.. [29]) wordt het viraal materiaal geoogst door het te onderwerpen aan 3 vriesdooistappen. Hierbij bevriest men het virus gedurende 2 uur bij -80^C om het daarna te ontdooien bij 4^C. Deze procedure herhaalt men 2 keer en is nodig om het resterende materiaal los te krijgen. Daarna brengen we de inhoud van de Rouxflessen over naar centrifugatiebuizen en centrifugeren deze gedurende 10 minuten bij 3000 t.p.m. (1000xG) (Super Minor centrifuge [MSE]). Dit zorgt voor een scheiding van het viraal materiaal (dat in het supernatans terechtkomt) en het cellulair materiaal (dat gepelleteerd wordt). Het supernatans ondergaat daarna een ultracentrifugatiestap in een TFT 70.38 rotor gedurende 1 uur 30 minuten aan 40 000 t.p.m. (130 000xG) bij 4^C. Hierbij wordt het viraal materiaal gepelleteerd, zodat men het supernatans kan verwijderen, waardoor men het virus concentreert. Men resuspendeert het pellet in 250 $\mu$l trisbuffer en bepaalt hiervan de titer via plaquetitratie (zie sectie 2.2).

2.2 Plaquetitratie

2.2.1 Principe

Met deze techniek bepaalt men het aantal infectieuze partikels in een virale suspensie. Dit doet men door gevoelige cellen in een petrischaal tot een monolaag te laten groeien en ze daarna in contact te brengen met verschillende verdunningen van het virus. Ten gevolge van de infectie neemt men plaques (= zones van celdestructie te wijten aan in vitro virusinfectie) waar. De Plaque Forming Unit (p.f.u.) is dus een maat voor het aantal infectieuze virusdeeltjes waarbij elke plaque overeenkomt met de hoeveelheid cellyse, die oorspronkelijk geïnduceerd werd door 1 viraal partikel.

2.2.2 Praktisch

We maken een tienvoudige verdunningsreeks van het virus in trisbuffer (pH 7.4) (zie bijlage A.2), vertrekkende van de verdunning 10$^{-2}$ tot 10$^{-7}$ via de meesleeptechniek. Deze verdunningsreeks kan, afhankelijk van de vereisten, aangepast worden.

De petrischaaltjes (diameter = 55 mm) met L-929 cellen worden nu uit de incubator gehaald. Het medium wordt weggezogen en op elk schaaltje wordt 100 $\mu$l van een bepaalde verdunning gebracht. Er wordt 1 schaaltje ter controle gebruikt. Dit zal 100 $\mu$l trisbuffer bevatten. We verdelen de vloeistof volledig over het oppervlak van de petrischaaltjes door ze te kantelen en plaatsen ze 15 minuten in de incubator zodat het virus kan adsorberen. Daarna kantelen we de plaatjes opnieuw. We herhalen deze procedure 3 keer. Gedurende de laatste 15 minuten maken we het overlaymedium klaar. Hiervoor gebruiken we steriele agar (1.6%) die we laten smelten. Daarna koelen we deze agar (bekomen bij Difco) af omdat de cellen en het virus bij het opbrengen van een te hete agarlaag zullen degraderen. Voor het overlaymedium gebruiken we 50 delen agar (een colloïdale gelatineuze stof die wordt toegevoegd om de mobiliteit van het virus te beperken tot zijn naaste omgeving), 50 delen dubbelgeconcentreerd medium en 1% paardenserum. We gebruiken eenzelfde volume (20 ml) dubbelgeconcentreerd medium (MEM2x, bijlage A.1) omdat de agar voor een verdunningsfactor zorgt en de cellen nog 3 dagen in optimale conditie moeten verkeren vooraleer ze gefixeerd worden. In het recipiënt komen dus achtereenvolgens het medium, het serum en de agar. We vortexen. De petrischaaltjes worden uit de incubator gehaald en er wordt telkens 5 ml overlaymedium op de schaaljes gebracht. We laten deze nu 3 dagen incuberen in een $CO_2$-oven (5% $CO_2$ op 37^C). Daarna nemen we een 10%-ige formaldehyde-oplossing en brengen op elk schaaltje 5 ml formaldehyde. Dit is nodig om de monolayer te fixeren zodat deze er niet afkomt bij het verwijderen van de agar. We laten het fixatief 35 à 40 minuten inwerken. Daarna zuigen we de formaldehyde eraf en verwijderen de agar voorzichtig met een spatel zodat de monolayer niet wordt aangetast. Tenslotte brengen we 3 ml kristalviolet-oplossing^2.1 (10% verdunde oplossing van 10 g kristalviolet, 100 ml ethanol en 400 ml $H_2O$) op de schaaltjes en laten deze gedurende ongeveer 30 minuten de levende cellen kleuren. Op die manier worden de plaques zichtbaar als niet-gekleurde regio's. We spoelen de petrischalen met $H_2O$ en laten ze aan de lucht drogen. Tenslotte kunnen de plaques geteld worden en kan de virustiter bepaald worden, rekening houdend met de verdunningsfactor en de hoeveelheid virussuspensie opgebracht.

2.3 $^{35}$S L-methionine merking

2.3.1 Principe

We voegen $^{35}$S L-methionine toe aan de geïnfecteerde cellen met als doel het virus te merken. Dit aminozuur wordt immers in de proteïnen geïncorporeerd tijdens de proteïnensynthese. Om een efficiënte opname van het toegevoegde isotoop te verzekeren, worden de cellen eerst uitgeput aan methionine.

2.3.2 Praktisch

We brengen 100 $\mu$l virussuspensie op de cellen en laten het 1 uur adsorberen bij 37^C in een incubator met 5% $CO_2$, waarbij we de schaaltjes elke 15 minuten kantelen. De controle voorzien we met 100 $\mu$l trisbuffer. Ondertussen maken we het medium klaar. Dit bestaat uit MEM (zie bijlage A.1) zonder methionine, maar met 1mM natriumpyruvaat- en een 2mM glutaminesupplement. Standaard brengen we 850 $\mu$l medium op de cellen.

We plaatsen de petrischalen terug in de incubator totdat het cytopathogeen effect optreedt (ongeveer 5 uur p.i.). Dan voegen we 50 $\mu$l Tran $^{35}S$ label (ICN Biomedicals) toe. Dit label is afkomstig van een cellulair hydrolysaat van E. Coli dat meer dan 70% methionine bevat. Het bevat ook andere gemerkte (bv. cystine) en niet-gemerkte componenten.

Vervolgens laten we het isotoop gedurende zekere tijden^2.2 incorporeren waarna we de cellen lyseren door english110 $\mu$l lysebuffer (PBS-buffer pH english7.4 (bijlage A.2english), 5% DOC (Na-deoxycholaat) en 10% Triton X-100) toe te voegen. Daarna vriezen we de cellen in bij -80^C.

2.4 Vloeibare scintillatietelling

2.4.1 Principe

Vloeibare scintillatietelling (zie fig 2.1) is de meest gevoelige techniek voor de detectie en de meting van de radioactiviteit in een monster. Voor de metingen kan men zowel $\alpha,\beta,\gamma$-stralers als electronenvangende radionucliden gebruiken [42]. In het scintillatieproces kan men verschillende stappen onderscheiden:

1. De absorptie van energie door een aromatisch solvent.
2. De vorming van de geëxciteerde toestand van het solvent.
3. De energieoverdracht van het solvent naar de scintillatormolecule, waardoor dit ook aangeslagen wordt.
4. De fluorescente emissie door het scintillatormolecule.
5. De omzetting van het uitgezonden licht naar een electrisch signaal in de 'photomultiplier tube' of PMT.

Figure 2.1: Het scintillatieproces[21].

Dit proces gebeurt met een maximale efficiëntie d.w.z. met een minimaal verlies aan energie. Om de electrische signalen te versterken, wordt aan het monster een scintillatiecoctail toegevoegd. Deze bestaat uit een solvent (tolueen, xyleen,..), een emulgator en een fluorescerend scintillatormolecule [21].

Problemen die bij deze techniek kunnen opduiken zijn enerzijds interferentieproblemen zoals chemoluminescentie of fotoluminescentie en anderzijds quenching (= het fenomeen dat tot een lagere scintillatietelling leidt) [21].

2.4.2 Praktisch

Men brengt het gewenste volume monster in een telflesje en voegt er 3 ml scintillatiecoctail (Optiphase HiSafe 3) aan toe. De telflesjes worden gesloten en geschud. Daarna worden ze in de vloeibare scintillatieteller (model Wallac 1409) geplaatst en wordt het programma gestart. Wij gebruiken de programma's waarbij men 1 of 3 minuten kan tellen met of zonder het afdrukken van een grafiek. In deze thesis werden enkel de grafieken van de '3 minuten'-tellingen opgenomen.

2.5 Dialyse

2.5.1 Principe

Met deze techniek verwijderen we de overmaat aan niet-geïncorporeerd radioactief materiaal door de semipermeabele membraan van een dialysecassette. Dit is nodig omdat het $^{35}$S L-methionine slechts in beperkte mate wordt opgenomen aangezien 90-95% van dat isotoop in het medium terechtkomt. Als we het niet zouden verwijderen, zou dit tot een hoge radioactieve achtergrond leiden. We gebruiken Slide-A-Lyser$^{\circledR}$ dialysecassettes (Pierce), die bestaan uit 2 semipermeabele membranen omgeven door een plastic ``raamwerkje'' waarbij op de hoekpunten ervan telkens één genummerd gaatje terug te vinden is. We gebruiken cassettes met een cutoff van 10 000 Da, waarbij het niet-geïncorporeerde radioactief materiaal verwijderd wordt, maar de grotere radioactief gemerkte virusdeeltjes in de cassette achterblijven.

2.5.2 Praktisch

Elk monster, afkomstig van de petrischalen, werd verzameld in een apart Eppendorf cupje met de vermelding van het monster erop. Op elke dialysecassette brengt men hetzelfde merkteken aan als dat van het overeenkomstige Eppendorf cupje. Dan zuigt men m.b.v. een steriele naald en spuit de virale suspensie op. T.h.v. één van de 4 genummerde gaatjes doorprikt men voorzichtig het silicone deel binnenin de cassette totdat men de naald tussen de 2 membranen ziet verschijnen. Men spuit het virale materiaal in de cassette. Dit wordt getoond in figuur 2.2A.

Figure 2.2: Dialyse [26]

A.

Door de naald wat terug te trekken en de zuiger weer omhoog te halen, zuigt men de lucht uit de cassette zodat de vloeistof volledig tussen de twee membranen verdeeld is. De cassettes worden nu op een grote vlotter bevestigd die samen met een magneetje in een recipiënt met ongeveer 1 à 1.5 liter dialyse-buffer (zie bijlage A) terechtkomt (zie figuur 2.2B). Het recipiënt wordt op een magnetische roerder geplaatst zodat een vloeistofstroom ontstaat die de dialyse bevordert. Het dialyseproces gebeurt bij 4^C, om de degradatie van het monster t.g.v. de activatie van proteasen tegen te gaan. We vervangen de dialysebuffer in cycli van 1.5 uur zodanig dat de concentratiegradiënt behouden blijft en overtollig radioactief materiaal weggespoeld wordt. Telkens we de dialysebuffer vervangen, nemen we hiervan een monster van 500 $\mu$l en bepalen we de radioactiviteit ervan met de vloeibare scintillatieteller. We blijven dialyseren totdat de radioactiviteit tot een aanvaardbaar niveau van 300 à 400 c.p.m. gedaald is. Dan nemen we de dialysecassette en spuiten met een steriele naald en spuit lucht tussen de twee membranen, zodat de vloeistof eruit kan worden gezogen zoals in figuur 2.2C. Daarna verzamelen we het viraal materiaal in een Eppendorf cupje en tellen we 10 $\mu$l van elk monster via scintillatietelling. We centrifugeren het monster gedurende 5 minuten bij 15 000 t.p.m. (32xG) in een eppendorfcentrifuge en bepalen tenslotte het volume van het monster.

2.6 Sucrose-gradiënt ultracentrifugatie (SGU)

2.6.1 Principe

Bij sucrose gradiënt ultracentrifugatie (SGU) maakt men gebruik van hoge snelheden om partikels met een verschil in sedimentatiecoëfficiënt te scheiden. Daarbij brengt men het monster aan op een lineaire gradiënt van sucrose. Hierbij zullen zwaardere partikels sneller naar de bodem van de centrifugatiebuis migreren dan lichtere partikels. Op welke plaats het partikel zich uiteindelijk bevindt, is afhankelijk van de snelheid en de tijd van centrifugatie, de wrijvingscoëfficënt van het partikel, het moleculair gewicht van het partikel, de samenstelling van het omringende milieu en de afstand van de centrifugatiebuis tot het centrum van de rotor (zie sectie 2.6.2). Het gevaar bij dit soort centrifugatie bestaat erin dat als men te lang centrifugeert, alle partikels de bodem van de centrifugatiebuis bereikt zullen hebben, zodat men ze niet meer kan scheiden. De centrifugatiecondities die we gebruikt hebben zullen telkens opnieuw vermeld worden in sectie 3.

2.6.2 Praktisch

Figure 2.3: Schematische voorstelling van de gradientmaker [17].

We leggen een lineaire gradiënt van sucrose (bereid in PBS-buffer; pH 7.4) aan in een centrifugatiebuis m.b.v. het toestel Watson Marlow (Model 501). Dit bestaat uit 2 buizen A en B (zie figuur 2.3) die met elkaar verbonden zijn, zodat het principe van communicerende vaten hierop van toepassing is. Onderaan buis B vertrekt -vanaf een kraantje- een slangetje dat zich opsplitst in 6 vertakkingen, die elk op de bodem van een centrifugatiebuis uitmonden. Voor de aanmaak van de 5-30% sucrose gradiënt brengen we een 30%-ige sucrose oplossing in buis A en een 5%-ige oplossing in buis B. We draaien de kraan open zodat de 5%-ige vloeistof -die rechtstreeks in verbinding staat met de slang- zo in de centrifugatiebuizen loopt. Er treedt t.h.v. de buizen A en B een drukverandering op die gecompenseerd wordt door vloeistof die vanuit buis A naar buis B stroomt. Op die manier wordt de gradiënt langzaam opgebouwd. De vloeistof in de centrifugatiebuis wordt omhooggedrukt door de nieuwe vloeistof met een hoger percentage aan sucrose, zodat men uiteindelijk de 5% sucrose bovenaan de buis terugvindt en de 30% beneden. We plaatsen de centrifugatiebuizen nu gedurende 30 minuten bij 4^C.

Bij ultracentrifugatie maken we gebruik van een Centrikon T 1170 centrifuge en verschillende centrifugatiecondities. Voor een 15-30% gradiënt centrifugeren we 2 uur bij 39 000 t.p.m. (200 000xG) bij een temperatuur van 4^C, voor de scheiding van virale partikels met een sedimentatiecoëfficiënt groter dan 20S; voor een 5-30% gradiënt is dat 17 uur aan 35 000 t.p.m. (165 000xG) bij 4^C, voor de scheiding van virale partikels met een sedimentatiecoëfficiënt kleiner of gelijk aan 20S. Na de centrifugatie wordt elk monster in fracties van 400 $\mu$l uitgepompt m.b.v. de Isco Density Gradient Fractioner (Model 640) in Eppendorf cupjes voor verdere analyse of rechtstreeks in telflesjes voor scintillatietelling.

2.7 Immunoprecipitatie

2.7.1 Principe:

Monoclonaal antilichaam (MAb), specifiek voor een bepaald proteïne (hier anti-VP1) wordt aan een monster toegevoegd. In dit monster zal het MAb het viraal antigeen binden. De interactie tussen het virale antigeen en het antilichaam is zeer specifiek zodat enkel het viraal materiaal gebonden wordt. Dit Ab bestaat uit de Fab en de Fc fragmenten. Het Fc deel van het Ab heeft een grote affiniteit voor het oppervlakteproteïne, proteïne A, van S. aureus (Cowan I-stam). Op die manier wordt een complex (antigeen, antilichaam en bacterie) gevormd. De bacterie S. aureus wordt gebruikt omdat het een bron van proteïne A is en omdat het voor 'gewicht' bij het centrifugeren zorgt. Door centrifugatie kan het viraal materiaal van het cellulair materiaal gescheiden worden t.g.v. de sedimentatie van het antigeen/antilichaam/bacterie complex.

2.7.2 Praktisch:

De monsters die we aan immunoprecipitatie onderwerpen, brengen we op ijs, we vortexen ze en brengen van elk monster 80 $\mu$l in een afsluitbaar Eppendorf cupje. We voegen 10 $\mu$l 1:50 verdund MAb toe en laten de monsters 1 uur op het ijs incuberen zodat het antigeen aan het antilichaam kan binden. Hierna voegen we de bacteriële suspensie (S. aureus van de Cowan-stam) toe, en laten het geheel nog eens 30 minuten incuberen op ijs opdat het complex (antigeen/antilichaam/bacterie) gevormd kan worden. Daarna voeren we een centrifugatiestap uit in een Sigma 112 (B. Braun Biotech International) bij 15 000 t.p.m. (32xG) gedurende 5 minuten. Zo scheiden we het cellulair van het viraal materiaal. We nemen dan 80 $\mu$l van het supernatans en brengen dit in telflesjes voor een vloeibare scintillatietelling (zie sectie 2.4). De rest van het supernatans wordt afgepipetteerd en het pellet wordt geresuspendeerd in 500 $\mu$l NET-Triton X-100 buffer (bijlage A.2). Er volgt een centrifugatiestap van 5 min waarna het supernatans verwijderd wordt (men werkt ondertussen niet meer op ijs). Het pellet wordt geresuspendeerd in 140 $\mu$l 2% SDS en ondergaat dan een kookbeurt van 5 min. Tenslotte centrifugeert men 5 min (om het bacterieel materiaal te verwijderen) en neemt 70 $\mu$l van het supernatans voor vloeibare scintillatietelling. De rest wordt bij kamertemperatuur bewaard en eventueel aan SDS-PAGE (zie sectie 2.8) onderworpen.

2.8 SDS-PAGE

2.8.1 Principe

SDS-PAGE of sodium dodecylsulfaat polyacrylamide gelelectroforese wordt gebruikt om de samenstelling van proteïnen te bepalen [34].

Bij deze electroforese bewegen de geladen deeltjes o.i.v. een electrisch veld van de ene pool naar de andere. Hierbij komt hun bewegingssnelheid met hun moleculair gewicht overeen. De deeltjes migreren in een gel die onstaat door polymerisatie van acrylamide (AA) en NN' methyleenbisacrylamide (BAA) waarbij TEMED (N,N,N'N' tetramethylethyleendiamine) als catalysator optreedt. Vrije radicalen geproduceerd door ammoniumpersulfaat zorgen voor de initiatie van deze polymerisatie. De poriëngrootte van de gel bepaalt hoe snel de deeltjes kunnen bewegen en deze kan men aanpassen door de concentraties van AA en BAA te wijzigen [40].

De SDS-PAGE bestaat eigenlijk uit 2 gelcompartimenten: een stapelingsgel en een scheidingsgel. De stapelingsgel bevat grote poriën en gebruikt men opdat alle monsters op dezelfde hoogte zouden starten. De poriën van de scheidingsgel zijn wat kleiner t.g.v. een hogere AA-concentratie en zorgen voor de scheiding van de gedegradeerde proteïnen.

Bij de gel voegt men vaak ook additieven zoals reducerende agentia [$\beta$-Mercaptoethanol (100 mM) of Dithiothreitol (20 mM)] of detergenten [bv: Triton X-100]. In dit geval brengen we het proteïnenmengsel met Sodium Dodecyl Sulfaat (SDS) in contact. Dit anionisch detergens zorgt zowel voor de degradatie van de proteïnen als voor een netto negatieve lading in het mengsel door binding van deze gedegradeerde proteïnen. Hierdoor kunnen ze niet meer volgens lading gescheiden worden, maar wel volgens moleculair gewicht. Door een electrisch veld aan te leggen zullen de negatief geladen proteïnen door de gel migreren naar de positieve pool (de anode). Dit gaat sneller voor proteïnen met een kleiner moleculair gewicht zodat deze lichtere proteïnen dieper in de gel migreren dan de zwaardere.

2.8.2 Praktisch

Table 2.1: Samenstelling van de stapelings- en de scheidingsgel

Scheidingsgel

Stapelingsgel Acrylamide 50%

We brengen standaard een volume van 60 $\mu$l per slot op de gel. Dit volume bestaat voor 54 $\mu$l uit het virale monster waaraan 6 $\mu$l denaturatiebuffer [7.76 ml Tris HCl (pH 6.8), 0.01 g broomfenolblauw (BFB), 5 g sucrose, 2 g SDS en 2.24 ml mercaptoethanol] wordt toegevoegd, waarna de monsters gekookt worden. Elke gel bevat 1 controle bestaande uit 160S virionen die zoals de monsters worden behandeld.

Vervolgens maken we de stapelings- en scheidingsgel klaar (zie tabel 2.1). TEMED wordt als laatste component toegevoegd omdat deze de catalysator van de reactie is, die door $O_2$ wordt tegengewerkt. Daarna nemen we glazen platen die we met klemmen m.b.v. een ``latje'' op 0.5 cm van elkaar vastklemmen. Langs de 2 zijkanten en de onderkant wordt een laagje agar (0.5%) gegoten zodat de gel niet kan weglopen. Men laat dit laagje even drogen. Daarna giet men de separatiegel tussen de platen en de kam (voor de slots) wordt ook aangebracht. Na een paar uur brengt men wat butanol op de meniscus van de scheidingsgel zodat die overal op dezelfde hoogte komt te staan. Men spoelt na met water en droogt met een filterpapiertje. Dan brengt men de stapelingsgel bovenop de scheidingsgel m.b.v. een pipet. Het geheel laten we een nacht rusten.

De loopbuffer bevat 30 g tris, 144 g glycine, 10 g SDS, aangevuld met gedestilleerd $H_2O$ tot 10 liter. We gebruiken een groot volume van deze buffer omdat het voor de afkoeling van het electroforesetoestel en de gel zorgt en omdat pH-schommelingen in een groter volume niet zo drastisch optreden. De monsters worden in de slots van de gel gepipetteerd. Ze lopen ongeveer 3 uur bij 70 mA/gel.

Na electroforese wordt de gel 2 keer gedurende 10 minuten gewassen met spoelvloeistof (900 ml methanol, 900 ml $H_2O$, 200 ml ijsazijn). De gel blijft dan nog een nacht in deze vloeistof liggen. Daarna leggen we de gel gedurende 15 minuten in Amplify (Amersham) zodat de omzetting van radioactieve straling naar licht kan plaatsvinden. Tenslotte wordt de gel gedurende 1.5 uur gedroogd en met een fotografische film (Kodak Biomax MR-1) in contact gebracht. Afhankelijk van hoe sterk radioactief de monsters zijn, blijft de gel een aantal dagen (ongeveer 14 dagen) bij -80^C liggen. De ontwikkeling van de film gebeurt in een donkere kamer: de fotografische plaat wordt ongeveer 5 minuten in een 1:5 verdunde ontwikkelingsvloeistof (LX24 van Kodak) gelegd en vervolgens gespoeld met $H_2O$. Tenslotte fixeren we de film gedurende 5 minuten in een 1:5 verdunde fixeeroplossing (AL4 van Kodak) waarna deze opnieuw met water gespoeld wordt.