1. Inleiding

Het virus (Theiler's Murine Encefalomyelitis Virus of TMEV) waarvan de morfogenese in deze thesis bestudeerd wordt, behoort tot de picornavirusfamilie of de picornaviridae. Vandaar dat deze familie eerst in het kort besproken wordt, alvorens dieper op het TMEV in te gaan.

1.1 Picornaviridae

Het woord ``picorna'' is afkomstig van ``pico'' (een heel kleine unit van $10^{-12}$) en ``RNA'' (het ribonucleïnezuur waaruit het viraal genoom bestaat). Met picornaviridae worden dus zeer kleine RNA virussen bedoeld [10].

1.1.1 Classificatie

De picornavirusfamilie behoort tot de meest diverse groep virussen die tot nu toe beschreven zijn. Oorspronkelijk werd deze familie verdeeld in genera op basis van hun fysico-chemische en serologische eigenschappen, nu gebeurt dit o.b.v. hun nucleotidensequentie [10]. Momenteel zijn er 9 genera bekend [25]: de Aphthovirussen (bv: Foot-and-Mounth Disease) die enkel vertebraten infecteren, de Cardiovirussen (waarbinnen 2 subtypes: Encefalomyocarditis Virus en Theilovirus) die een variëteit aan gastheren infecteren en soms neurodegeneratief kunnen zijn, de Enterovirussen (waarbinnen 8 subtypes o.a. Poliovirussen, Coxsackievirussen groep A en B, Echovirussen, ...) die het gastro-intestinaal stelsel van zowel mensen als dieren infecteren, de Hepatovirussen (bv. Hepatitis A), de Rhinovirussen (waarbinnen ongeveer 105 serotypes bv: het Humaan Rhinovirus-2 of het Humaan Rhinovirus-14) die repliceren in de nasofarynx en zuurlabiel zijn, de Erbovirussen (bv. Equine Rhinitis B Virus), de Kobuvirussen (bv. Aichi Virus) die een oester-geassocieerde gastro-enteritis bij mensen veroorzaken [3], de Teschovirussen (bv. Porcine Teschovirus) en de Parechovirussen (bv. Humaan Parechovirus A en B) die gastrointestinale en respiratoire problemen veroorzaken bij kinderen [27]. Tot op heden blijven er echter nog een aantal virussen over die nog niet zijn ingedeeld bij een bepaald genus.

1.1.2 Kenmerken

1.1.2.1 Genomische eigenschappen

Karakteristiek voor de picornaviridae is het enkelstrengig, positief RNA-molecule dat omgeven wordt door een proteïnenmantel (= capside). Het geheel wordt het nucleocapside genoemd en is niet door een lipiden-envelop omgeven. Men noemt ze daarom ``naakte'' virussen. Doordat het RNA-molecule positief is, kan het direct fungeren als messenger RNA (mRNA) zodat de proteïnensynthese snel kan starten na infectie. De enzymen die vereist zijn voor de replicatie hoeven immers niet met het virion getransporteerd te worden omdat ze direct aangemaakt worden door translatie van het RNA. In dit RNA zijn alle genen aanwezig op 1 chromosoom zodat eerst een polyproteïne ontstaat, dat daarna gekliefd wordt om individuele, functionele proteïnen te genereren (zie figuur 1.3).

Het genomisch RNA (zie figuur 1.1) bestaat uit een coderend gebied dat geflankeerd wordt door 2 niet-coderende regio's (UTR) aan het 5' en 3' uiteinde. De UTR t.h.v. het 5' uiteinde bestaat uit 600-1200 basen en is belangrijk bij translatie en virulentie [52]. Ze bestaat uit 2 onafhankelijke domeinen: een ``cloverleaf'' (d.i. een structuur met 4 basenpaarstammen en 3 loops) dat betrokken is bij de synthese van de positieve RNA-streng en een secundaire structuur die de Internal Ribosome Entry Site of kortweg IRES wordt genoemd en de translatie van het polyproteïne stimuleert [41]. Er is geen 5' capstructuur verbonden met het viraal genoom. Dit is in cellulaire eukaryote mRNA's wel aanwezig en zorgt er voor de binding tussen mRNA en ribosomen. Enerzijds zorgt deze capstructuur voor de initiatie van de translatie en anderzijds beschermt het de groeiende RNA-streng tegen degradatie [18,34]. Het gevolg is dat er bij de inhibitie van de 5' capregio van het cellulaire mRNA geen translatie optreedt, terwijl translatie voor het virale mRNA wel gebeurt [44]. Bijgevolg zal de synthese van het virale genoom wel optreden, terwijl de cellulaire replicatie wordt lamgelegd. Dit fenomeen noemt men host shut-off.

T.h.v. dit 5' uiteinde is het proteïne, VPg (Viraal Proteïne aan het genoom vastgehecht) covalent via zijn (enige) tyrosineresidue d.m.v. een autokatalytische reactie aan het virale genoom vastgehecht. Dit basische proteïne speelt een essentiële rol bij de initiatie van de RNA-synthese [44,49,57].

Figure 1.1: Het Picornagenoom [27].

Aan het 3' uiteinde vinden we een UTR van 50-100 basen terug waarachter een polyadenylatiesignaal (= polyA-staart) gekoppeld is. Dit is belangrijk voor de stabiliteit van het vRNA. Zonder deze staart verliest het virus haar infectiviteit. De regio van het genoom tussen beide UTR's codeert voor één polyproteïne van 2100-2400 aminozuren dat post-translationeel gekliefd wordt (zie sectie 1.1.3) [30,39,55].

1.1.2.2 Het oppervlak

Vermits virussen een beperkte hoeveelheid genetisch materiaal ter beschikking hebben, worden de proteïnen in een zo eenvoudig mogelijke conformatie geplaatst (icosahedraal of helicaal) [12]. Het capside van de picornaviridae bestaat uit 60 protomeren van elk 4 polypeptiden (VP1, VP2, VP3, VP4). Eén enkel virion is 25-30 nm en heeft een icosahedrale vorm. Een icosahedron bevat 20 driehoeken en 12 hoekpunten die gevormd worden door pentameren (zie sectie 1.1.3) [34,55].

D.m.v. antilichamen heeft men de Neutraliserende Immunogene sites of NIm sites kunnen detecteren. Deze NIm sites omgeven de 5-voudige symmetrieas als grote instulpingen (depressies) in het capside die men canyons noemt. Bij aphthovirussen en cardiovirussen spreekt men van pits (dit zijn ``kuilen'' rond de 5-voudige symmetrie). Ze verzorgen een bindingsplaats voor de antilichamen van de gastheer zodat het virion geneutraliseerd wordt. De sequenties t.h.v. deze sites kunnen gemoduleerd worden opdat het virus aan de neutralisatie van de gastheercel zou kunnen ontsnappen. Op de bodem van de canyon en de pit zelf vindt men de geconserveerde site voor receptorbinding [12,36].

1.1.2.3 Interne structuur

Aan de binnenzijde van het virion wordt de stabiliteit gegarandeerd door de interactie van een netwerk van N-terminale structuren van de capsideproteïnen [30]. Het VP4-proteïne speelt hier een belangrijke rol dankzij zijn myristaatgroep ($C_{14}H_27O_2$) die covalent aan zijn N-terminale glycine is vastgehecht [4].

1.1.2.4 Fysische en chemische karakteristieken

De stabiliteit van een virion wordt niet enkel bepaald door de interacties aan de binnenzijde van het virion, maar ook door een aantal fysicochemische factoren zoals moleculaire massa, densiteit, en temperatuurs- en pH-stabiliteit, de aan-of afwezigheid van detergenten...

De moleculaire massa van picornavirionen bedraagt 8 à 9 x $10^9$ Da en ze sedimenteren bij 140 à 160S [49].

De densiteit van de verschillende leden van de Picornavirusfamilie kan gemeten worden door ze bijvoorbeeld aan centrifugatie met cesiumzouten te onderwerpen. De permeabiliteit voor cesium is verschillend voor de afzonderlijke leden van de familie. De cardiovirussen hebben bijvoorbeeld een lage densiteit (ongeveer 1.34 mg/l) omdat cesium niet tot in het capside kan doordringen [30].

Een verandering van de temperatuur kan het virus destabiliseren. Men kan zijn temperatuursgevoeligheid testen door zijn vermogen tot plaquevorming te bestuderen [45].

Enkele genera (bv. cardiovirussen en enterovirussen) blijven stabiel in de aanwezigheid van een zure pH, dit is nodig omdat ze door de maag van hun gastheer moeten passeren om een nieuwe gastheer te kunnen infecteren. Bij andere genera (rhinovirussen en aphthovirussen) initieert een verlaging van de pH de ontmanteling van het virus in de gastheercel (zie sectie 1.1.3) [30].

De virionen van de meeste picornaviridae zijn niet gevoelig aan chloroform, di-ethyl ether en non-ionische detergenten en zijn stabiel in de aanwezigheid van een aantal kationen [49].

1.1.3 Replicatiecyclus

De informatie over de replicatiecyclus (figuur 1.2) van de Picornaviridae werd voor het overgrote deel gebaseerd op experimenten met het poliovirus.

Figure 1.2: De Replicatiecyclus van de Picornavirussen.(1) De adhesie van het virion aan haar receptor. (2) De uncoating. (3) De translatie van het vRNA. (4) De replicatie van het RNA. (5) De morfogenese van het viraal partikel in verschillende stadia. (6) De vrijlating van nieuwe virionen [10].

1.1.3.1 Adhesie (fig. 1.2.(1))

In een eerste fase bindt het virus aan de oppervlaktereceptor van de gastheercel. Deze gastheerreceptoren zijn nog niet allemaal gekend voor elk lid van de familie. Bij het rhinovirus is de receptor bijvoorbeeld het ICAM-1 (Intercellulair Adhesie Molecule-1), voor het poliovirus is dat de poliovirusreceptor (PVR = CD155). Soms is receptorbinding alleen niet voldoende voor de opname van het virus en zijn er cofactoren nodig [55]. Het coxsackievirus A21 bijvoorbeeld bindt op het CD55 proteïne en heeft het ICAM-1 nodig voor de penetratie in de gastheercel.

1.1.3.2 Penetratie

De adhesie aan de receptoren van de gastheercel triggert bij een aantal virussen het proces van receptorbemiddelde endocytose (waarbij een membraaninstulping plaatsvindt en het vesikel met het virus in het cytoplasma wordt afgesnoerd). Een mogelijk mechanisme kan de clustering van sommige receptoren in clathrine gecoate pits zijn. Ze worden dan opgenomen in een clathrine-gecoat vesikel dat van de celmembraan wordt afgesnoerd en in het cytoplasma terechtkomt, waar het clathrine enzymatisch verwijderd wordt [34]. Daardoor kan de fusie van de afgesnoerde vesikels met het endosoom (een zure prelysosomiale vacuole) gebeuren, zodat de pH in het vesikel drastisch verlaagt. Op die manier wordt de ontmanteling geïnitieerd [55].

De penetratie van het vRNA kan ook d.m.v. porievorming gebeuren. Dit wordt geïnitieerd door een structurele verandering t.g.v. de binding van het ligand (= virus) aan zijn receptor. Op die manier kan dan het vRNA in het cytoplasma terechtkomen [30]. Men weet echter nog niet precies wat er gebeurt bij de verschillende virussen, bovenstaande voorbeelden zijn mogelijkheden van de mechanismes betrokken bij de penetratie.

1.1.3.3 Ontmanteling (fig. 1.2.(2))

Bij receptorgemedieerde endocytose triggert de verzuring van het vesikel een conformationele verandering van het capsideproteïne VP4, dat intern in het capside gelegen is. Hierdoor komt het virale RNA-molecule in het cytosol terecht, waar het VPg proteïne van dit RNA-molecule gekliefd zal worden door cellulaire ``unlinking'' enzymen zodat dit RNA direct als mRNA kan fungeren [55,30]. Ook hier bestaat nog geen eenduidigheid over het mechanisme van deze ontmanteling.

1.1.3.4 Proteïnensynthese (fig. 1.2.(3) en fig 1.3)

Het positieve RNA-molecule is nu in de cel terechtgekomen en kan er vertaald worden naar proteïnen die nodig zijn voor het vervolg van de replicatiecyclus en voor de vorming van een nieuw capside. Dit gebeurt d.m.v. het IRES (zie sectie 1.1.2) dat gelocaliseerd is t.h.v. de 5' terminus waar de translatie start. Het opmerkelijke aan dit proces is dat het resultaat hiervan één enkel polyproteïne van ongeveer 255 kDa is (fig. 1.3.A). Posttranslationele klieving van dit polyproteïne geeft aanleiding tot de precursorproteïnen P1 (93kD); P2 (52kD); P3 (88kD) (zie fig. 1.3.B) [33]. Elk van deze proteïnen genereert op zijn beurt door middel van klieving nieuwe proteïnen volgens de (L-)4-3-4 polypeptide schikking. In totaal worden er 12 proteïnen gevormd (fig. 1.3.C): voor het P1 precursorproteïne zijn dat VP0 (= 1A/1B), VP1(1D) en VP3(1C), waarbij VP0 op zijn beurt tijdens de maturatieklieving zal splitsen in VP2 (= 1B) en VP4 (= 1A) [30,33] . Deze structurele proteïnen maken allemaal deel uit van het nieuwe virale capside. Vanaf het precursorproteïne P2 ontstaan 3 nonstructurele proteïnen waarvan er één een protease-activiteit bezit [44]. 2A$^{pro}$ (een protease) en 2BC, dat na het ontstaan uit het P2 proteïne aanleiding geeft tot 2B en 2C (dat mogelijk betrokken is bij de scheiding van de virale RNA-strengen tijdens replicatie [44,49]). Uit het P3 precursorproteïne ontstaan de proteïnen 3AB en 3CD die op hun beurt gekliefd worden in 4 afzonderlijke proteïnen waarvan er één een RNA-afhankelijk RNA polymerase nl. 3D is. Dit zal voor de polymerisatie van het vRNA verantwoordelijk zijn.

Figure 1.3: Proteïnensynthese [10]. Het polyproteïne (A) wordt gekliefd in precursorproteïnen (B) P1, P2, P3. Deze geven op hun beurt aanleiding tot individuele proteïnen (C)

Het 3C protease is, net als het $2A^{pro}$, verantwoordelijk voor de klieving van het virale polyproteïne en de inhibitie van de cellulaire replicatie [30,44,33]. Het VPg of 3B is onmisbaar voor de initiatie van de virale RNA-synthese. Over het 3A-proteïne van het poliovirus is geweten dat het een invloed heeft op de uridylylatie van het VPg en dat het essentieel is voor de RNA-synthese [44,57]. Het L-proteïne gecodeerd door de L-sequentie t.h.v. het 5' uiteinde van het vRNA komt enkel voor bij cardio- en aphthovirussen (en dus niet bij de andere picornaviridae). Bij het Foot-and-Mounth-Disease Virus (FMDV) heeft dit L-proteïne een protease activiteit, terwijl dat niet het geval is bij de cardiovirussen. Mogelijk beïnvloedt dit proteïne de neurovirulentie. Een andere functie van dit proteïne ligt misschien in de regulatie van het IRES [49].

1.1.3.5 Host shut-off

Host shut-off is het fenomeen waarbij de cellulaire replicatiecyclus wordt lamgelegd ten voordele van de virale. Bij aphthovirussen is het L-proteïne verantwoordelijk voor deze shut-off, terwijl het 2A$^{pro}$ bij entero- en rhinovirussen voor host shut-off zorgt. Dit gebeurt onder andere door de klieving van het eIF4G, dat nodig is voor de cap-afhankelijke translatie van cellulair mRNA [53,6].

1.1.3.6 RNA-synthese (fig. 1.2.(4))

In een volgende stap wordt de replicatie van het vRNA geïnitieerd door de covalente binding van het gevormde primerproteïne VPg aan het 5' uiteinde. Hier kan het polymerase 3D binden en een nieuwe RNA-streng met negatieve polariteit synthetiseren. Verschillende RNA-polymerase enzymen zullen op het RNA-molecule met negatieve polariteit binden en zo verder groeien aan de matrijs zodat er een multistrengig replicatief intermediair complex (RI) ontstaat. De verschillende positieve progenitor RNA-strengen die op die manier ontstaan kunnen dan elk ofwel als mRNA ofwel als matrijs voor de productie van meer (-) RNA dienen [55].

1.1.3.7 Morfogenese (fig. 1.2.(5), fig. 1.4)

Figure 1.4: De morfogenese [10].

De icosahedrale structuur van de picornavirussen komt tot stand door de vereniging van een aantal proteïnen tijdens de morfogenese van de replicatiecyclus. Het proces komt op gang als de concentratie van de afzonderlijke proteïnen en RNA hoog genoeg is. De eerste structuur die op die manier ontstaat, heeft een sedimentatiecoëfficient van 5 S (Svedberg) en bestaat uit 3 virale proteïnen die afkomstig zijn van het precursorproteïne P1 (zie fig.1.3): het VP0 (viraal proteïne 0), het VP1 en het VP3. Ze wordt een protomeer genoemd (fig.1.4.(1)). Vijf van zo'n virale protomeren zullen daarna samen een pentameer van 14S vormen (fig.1.4.(2)). Voor de vorming van een provirion (+/- 80S) zijn er 12 pentameren nodig (fig.1.4.(3)). Daarna wordt het vRNA in dit provirion opgenomen en vindt de maturatieklievingplaats. Hierbij wordt het VP0 proteïne in VP2 en VP4 gekliefd zodat een 160S infectieus virion ontstaat (fig.1.4.(4)) [55,30,50]. De meeste intermediairen zijn voldoende gekarakteriseerd, maar er is echter nog geen eenduidig bewijs over de functie en karakterisatie van het 80S intermediair. Er zouden 3 mogelijkheden zijn. De 80S intermediairen zouden een opslagpartikel zijn voor 14S materiaal zolang de RNA-synthese nog niet gestart is. Bij RNA-synthese zou dit partikel terug uiteenvallen in 14S deeltjes waarin het vRNA geïncorporeerd wordt, waarna de maturatieklieving optreedt zodat een nieuw infectieus virion ontstaat. Een andere mogelijkheid is dat het RNA direct geïncorporeerd wordt en een 150S partikel vormt. Daarna treedt de maturatieklieving op met vorming van het 160S partikel [30]. Tenslotte bestaat de mogelijkheid dat het 80S partikel een 'dead end' partikel is. D.w.z. dat het ontstaat wanneer er geen vRNA meer ter beschikking is (dit gebeurt dus na de stopzetting van de vRNA-synthese) om een matuur virion te vormen [50].

Men ging ervan uit dat alle virussen behorende tot de picornavirusfamilie volgens dezelfde manier opgebouwd worden, hoewel er virussen zijn die hier en daar afwijken van deze algemene opbouw:

• Het Hepatitis A virus (HAV) wijkt af van het gemeenschappelijke patroon voor morfogenese. Men vindt hier 14 à 17S pentameren, 70S lege capsiden (opgebouwd uit VP0, VP1 en VP3) en 160S virionen (uit VP1, VP2 en VP3). Merkwaardig genoeg werden er geen 5S protomeren teruggevonden. Dit zou te wijten zijn aan een snelle assembly. Men vermoedt dat het protomeer, net als het pentameer en het lege capside, uit het VP0, het VP3 en het VP1-2A (i.p.v. het VP1 bij de andere leden) bestaat. Men zag ook dat de maturatieklieving vertraagd optrad, dat het daaruit resulterende VP4 niet gemyristoyleerd was en dat het slechts één derde van de normale lengte van het VP4 had. Ook t.h.v. het proteïne 2A nam men verschillen waar. Bij het HAV was dit proteïne proteolytisch inactief en vormde het een deel van het precursorproteïne P1-2A, waar het als signaal voor de morfogenese van pentamere structuren zorgt. [9,46].
• Bij het Foot-and-Mounth Disease Virus vond men na in vivo infectie 14S, 70S en 140S partikels terug. De 14S pentameren bleken kortlevend te zijn i.t.t. het 70S lege capside dat stabiel was. Dit 70S partikel bleek geen RNA, maar wel een kleine hoeveelheid VP2 en VP4 te bevatten. Bij het celvrije systeem werden 5S, 14S, 60 à 70 S en 110S partikels teruggevonden. Het labiele 110S partikel kon men neerslaan met 140S MAb, wat suggereert dat er op dit partikel tenminste 1 epitoop aanwezig is dat men ook terugvindt op het virion. Toch is dit 110S partikel geen virion daar de maturatieklieving nog niet is opgetreden en het niet infectieus is [23]. Of er vRNA in dit partikel is opgenomen kan men niet met zekerheid zeggen [49]. Bij onderzoek van de virale proteïnen bleek dat het VP4-proteïne van dit virus ook geen myristaatgroep bevatte [23,1].
• Bij het Mengovirus werden er 5S en 13 à 14S opbouwpartikels gevonden [7], maar over het bestaan van andere intermediaire partikels bestaat geen éénduidigheid: er worden andere partikels gegenereerd naargelang het type cellijn men gebruikt [15]. De lege capsiden zijn er instabiel, zodat ze bijgevolg moeilijk geïsoleerd kunnen worden [48]. Wat de virale proteïnen betreft, vond men in sommige gevallen 2 verschillende C-terminale uiteinden van het VP1: in vitro eindigde het VP1 op Glu277, terwijl dat Leu274 was bij in vivo virion assembly. Dit proces trad echter niet altijd op: men zag eerder een mengsel van de 2 verschillende uiteinden [8].
• Bij het Parechovirus en het Aichivirus treedt er geen maturatieklieving van VPO naar VP2 en VP4 op, zodat het capside slechts 3 virale proteïnen bevat. Het proteïne 2A van deze virussen blijkt, net als bij het HAV, geen proteolytische activiteit te hebben. Deze 2A-proteïnen lijken op een familie van cellulaire proteïnen die geassocieerd is met de controle van celproliferatie [27].
• Het TMEV zou ook een uitzondering kunnen zijn (zie sectie 1.2). Bij de GDVII-stam van dit virus heeft men een 5S, een 80S (opbouwpartikel) en een 160S partikel teruggevonden, maar een 14S opbouwpartikel ontbrak, in plaats daarvan vond men een 20S opbouwpartikel (men onderscheidt opbouw- van afbraakpartikels o.b.v. hun proteïnensamenstelling, het tijdstip van het verschijnen van het partikel en eventueel de stabiliteit van het partikel) [50]. Men weet dat het 20S partikel uit een VPO, VP1 en VP3 proteïne bestaat, maar men heeft geen verklaring voor zijn hoge sedimentatiecoëfficiënt. Om dit partikel beter te bestuderen moet het in voldoende hoeveelheid aanwezig zijn. Dit vormde tot nu toe een probleem.

1.1.3.8 Vrijlaten van de infectieuze virionen (fig. 1.2.6)

Bij de picornavirussen gebeurt er geen budding (uitstulpen en afsnoeren van een vesikel van de membraan) i.t.t. virussen met een envelop. De virionen zullen vrijgelaten worden wanneer er zodanig veel infectieuze virionen in de cel aanwezig zijn, dat de cel zal lyseren. Op die manier komen de virale partikels in het extracellulair milieu terecht en kunnen ze nieuwe gastheercellen infecteren.

1.2 Het Theiler's Virus

Het Theiler's Virus is een virus met als natuurlijke gastheer de muis. In normale omstandigheden vindt men het terug t.h.v. het gastrointestinaal stelsel, enkel in uitzonderlijke gevallen zal het virus zich naar het centraal zenuwstelsel verplaatsen waar het virus de grijze stof zal aantasten. Het virus veroorzaakt dan een acute en meestal fatale encefalitis of een demyliniserende en persisterende ziekte. Tot het eerste neurovirulente subtype dat een acute encefalitis veroorzaakt, behoren de GDVII-, de FA-, en de Ask-1-stam [35]. Tot het tweede subtype of de Theiler's Originele stammen (de TO-groep) behoren de DA- (Daniels strain), de BeAn-stam, de $TO_4$-stam, de WW- en de Yale-stam. Dit subtype veroorzaakt in een eerste fase een acute poliomyelitis en in een tweede fase een chronische, demyeliniserende, multiple sclerose-achtige aandoening (zie sectie 1.3) [36]. In dat geval zal het virus persisteren t.h.v. de witte stof zodat er een verschuiving optreedt van de grijze naar de witte stof. Men noemt dit daarom een bifasisch ziektebeeld. Over de manier waarop de demyeliniserende stammen van het gastrointestinale systeem naar het CZS migreren, is weinig geweten. Waarschijnlijk gebeurt dit via axonale weg [24], hoewel een verspreiding via de hematogene weg of een combinatie van beide, ook tot de mogelijkheden behoort. Dit subtype werd voor het eerst ontdekt door Max Theiler in de jaren 30 vandaar de benaming TO of de Theiler's Originele stammen [33]. De twee subtypes lijken goed op elkaar wat betreft hun nucleotiden- en aminozuursequentie (resp. 90% en 95% homologie), dit ondanks het feit dat ze een totaal verschillend ziektebeeld veroorzaken [14]. Men denkt dat dit verschil in ziektebeeld een gevolg zou zijn van bepaalde epitopen op het virale capside die een rol spelen bij de persistentie [39].

Een eerste argument t.v.v. deze hypothese is het feit dat de pit (sectie 1.1.2) wat verschillend is van de rest van de leden van de picornavirusfamilie. Deze verschillen zijn vooral waarneembaar t.h.v. de loops van VP1 en VP2. Deze VP1 en VP2 loops zijn belangrijk voor de neutralisatie van antilichamen [33,36].

Een tweede argument vindt men bij chimere DA-virussen waarbij het capside vervangen werd door dat van de GDVII-stam. Deze virussen vertonen neurovirulentie. Het omgekeerde is ook waar, vervangt men het capside van de GDVII-stam door dat van de DA-stam, dan bekomt men een persisterende stam [45]. Deze persisterende stammen blijken een grotere affiniteit te hebben voor gliale cellen zoals microgliacellen en Schwanncellen (zie sectie 1.3) i.t.t. de neurovirulente variant. Vandaar dat een frequent voorkomend proteïne, het Peripheral Nerve protein Po, een potentiële receptor voor het TMEV zou kunnen zijn, vermits het enkel voorkomt op myeliniserende Schwanncellen [32]. Omdat het Theiler's virus enkel het CZS infecteert, zou het gebruik van deze receptor op Schwanncellen een mogelijk mechanisme kunnen zijn om van het gastrointestinale systeem naar CZS te migreren, via het perifeer zenuwstelsel. Men denkt eigenlijk dat het TMEV niet van één, maar van verschillende receptoren gebruikt om verschillende cellen te infecteren [32]. Voor de interactie met de waardcelreceptor maken persisterende stammen gebruik van carbohydraten (bv. siaalzuur -veel voorkomend bij gliale cellen in het CZS) en aminozuren i.t.t. de non-persisterende stammen die enkel aminozuren nodig hebben [58].

Een derde argument is dat er bij de infectie met het TMEV verschillende celtypen betrokken zijn. Eerst dacht men dat beide subtypes enkel neuronen aantastten in de vroege fase van de infectie. Later heeft men ontdekt dat de DA-stam ook astrocyten, macrofagen en microgliacellen aantastte, dit i.t.t. de GDVII-stam die dit niet doet [2]. Verder zag men in deze studie door intracerebrale inoculatie van de muis dat er een verschil was in het aantal geïnfecteerde cellen. Er werden 10 keer meer geïnfecteerde cellen teruggevonden bij de GDVII stam dan bij de DA-stam, hoewel de RNA synthese op cellulair niveau maar 3 keer meer was dan die voor de DA-stam. Wat de oorzaak van dit verschil was, werd niet verklaard. In een in vitro studie vond men dat de GDVII-stam 2 à 3 keer efficiënter was in het promoten van de translatie dan de BeAn en dat virale transcriptie 10 keer hoger was dan bij de BeAn streng [5].

1.2.1 Genomische Structuur

Het Theiler's virus bevat een positief enkelstrengig RNA-molecule van ongeveer 8.1kb dat in een ongeveer 10 uur durende replicatiecyclus wordt overgeschreven.

Figure 1.5: Theiler's virus genoom [51]

Het 5' uiteinde van het genoom heeft een lange UTR (1064 nt) (zie figuur 1.5). Deze hooggestructureerde regio bevat de sequentie die de replicatie en translatie van het genoom controleert. Men vindt er ook een polyC-sequentie van gemiddeld 80 à 120 nt lang, waarvan de lengte overeenkomt met de virulentie. D.w.z. verkort men deze polyC-sequentie dan vermindert de virulentie van het virus drastisch zodat het gevoeliger wordt aan de antivirale activiteit van de gastheer [49]. Deze polyC-sequentie wordt gevolgd door het IRES (zie sectie 1.1.2) dat de laatste 500nt van de UTR in beslag neemt [30]. Het AUG codon vanaf nt 1065 zorgt voor de afsluiting van het IRES en voor de start van de polyproteïnensequentie die ongeveer 6909 nt lang is. Deze regio zal vertaald worden in een enkel polyproteïne. Het terminale codon start t.h.v. nt 7972, zodat bij nt 7975 de 3' UTR wordt ingeleid. Ook deze regio bevat een secundaire structuur, nl. de pseudoknot die de controle van de vRNA-synthese voor zich neemt [30]. De 3' UTR wordt afgesloten met een polyA-staart, die belangrijk is voor de infectiviteit van het virus [33,5].

De polyproteïnesequentie bevat ook nog een L-sequentie die voor een L-proteïne (dat men enkel terugvindt bij de cardio- en aphthovirussen) codeert en zich vlak voor de P1 regio bevindt. . Dit zinkbindend proteïne wordt snel gekliefd van het virale polypeptide door het $3C^{pro}$ tijdens de translatie [4]. De persisterende stammen synthetiseren een bijkomende vorm van het L-proteïne, nl. het L*proteïne, vanaf een intern out-of-frame AUG codon binnenin de leadersequentie die geconserveerd is bij deze stammen. Bij deze stammen speelt dit proteïne een rol door de productie inhibitie IFN $\alpha/\beta$ die onmiddellijk na de virale infectie start, te inhiberen [53]. Bij de neurovirulente stammen is de L-regio ook aanwezig maar ontbreekt het AUG codon nodig voor de start van de translatie van het L*proteïne, t.t.z. het werd vervangen door een ACG codon [52,37]. Daardoor synthetiseren deze stammen het L*proteïne niet.

Cellulaire proteïnen blijken noodzakelijk voor de regulatie van de translatie omdat ze kritisch zijn voor de pathogeniciteit van het virus. Bij de GDVII-stam verzorgt het PTB (of het Poly-Tract Binding protein) of een homoloog (nPTB) voor een efficiënte translatie door aanpassing van de structuur van het IRES. Mutaties t.h.v. de bindingssites voor deze proteinen tasten de neurovirulentie aan en verhinderen de binding van PTB en nPTB. Het nPTB komt voor in het CZS en fungeert er als RNA chaperon [43].

1.3 Multiple Sclerose (MS)

1.3.1 Inleiding

Het zenuwstelsel is voor een groot deel opgebouwd uit gliale cellen en voor een kleiner deel uit neuronen (zie figuur 1.6C). Deze bestaan uit dendrieten (verantwoordelijk voor het opvangen van signalen), een cellichaam (gelegen in de grijze stof met een secretiefunctie) en een axon (dat instaat voor de voortgeleiding van een actiepotentiaal) met zijn terminale uiteinden (die vaak neurotransmittervesikels bevatten) [22]. In de periferie zijn de axonen omgeven door de Schwanncellen (glia-achtige cellen), deze wikkelen hun membraan een aantal keer rond het axon, zodat een meerlagige structuur ontstaat. Men spreekt van myeline als de cytosolische en de exoplasmische ruimte tussen de nabijgelegen membranen fors gereduceerd (al dan niet verdwenen) is. In het centraal zenuwstelsel produceren de oligodendrocyten (zie figuur 1.6D) de myeline, die zorgt voor een snellere informatieoverdracht. Anderzijds zijn er ook nog astrocyten (zie figuur 1.6A) die verantwoordelijk zijn voor de synthese en de secretie van neurotrofische factoren en zorgen voor het het verwijderen van neurotoxische factoren. De microglia (zie figuur 1.6B) zijn macrofaagachtige cellen die in normale omstandigheden niet actief zijn, maar geactiveerd worden door celschade. Ze zorgen voor het opruimen van het celdebris.

Figure 1.6: De cellen van het centraal zenuwstelsel[19]

A. Astrocyt

1.3.2 Wat is MS?

Multiple sclerose is een aandoening van het centraal zenuwstelsel, waarbij men zoals de naam het zegt vele sclerotische letsels terugvindt. Deze chronische ziekte gaat vaak gepaard met perivasculaire inflammatie en demyelinisatie. Epidemiologische gegevens tonen aan dat de ziekte meer bij vrouwen dan bij mannen voorkomt en bij een gemiddelde leeftijd van 20 à 40 jaar opduikt. MS kent een geografische verdeling waarbij mensen die verder van de evenaar wonen meer kans maken op de ziekte. Bij migratie naar een risicogebied in de puberteit stijgt de individuele kans op de ziekte ook. Bij emigratie na de puberteit neemt men het risico met zich mee. Enerzijds wijst dit op een omgevingsfactor en anderzijds ook op een genetische component [47,56].

Hoewel de oorzaak van de ziekte nog steeds niet gekend is, is het globale verloop van de ziekte wel min of meer duidelijk. In een eerste stadium wordt de bloedhersenbarrière aangetast door een tot nog toe onbekende factor. Endotheelcellen t.h.v. de bloedhersenbarrière brengen dan integrinen tot expressie. Deze trekken autoreactieve T-cellen naar de extracellulaire matrix aan. De T-cellen secreteren daar chemokines en integrines die zorgen voor de mobilisatie van secundaire inflammatoire cellen zoals macrofagen. Op die manier kan een trimoleculair complex (dit is het complex dat gevormd wordt door de T-celreceptor, het herkende antigeen en het MHC klasse II molecule van de Antigeen Presenterende Cel) gevormd worden dat bij aanwezigheid van de juiste cofactoren een secretoire en proliferatieve stimulans geeft aan de T-cel waardoor deze geactiveerd geraakt. Elk type van CD$4^+$ T-cel (Th1 en Th2) zal een andere reactie uitlokken maar het netto-resultaat is hetzelfde: het CZS wordt beschadigd [56].

1.3.3 Vormen

Figure 1.7: Stadia MS [47]

Klassiek onderscheidt men vier verschillende vormen [47,13,56]:

1. Beninge MS (zie figuur 1.7.1) : ongeveer 20% van de patiënten heeft deze vorm van MS. De symptomen bij deze vorm zijn voornamelijk niet-visuele sensorische stoornissen die volledig herstellen en geen blijvend ongemak met zich meebrengen. Men is dus niet permanent ziek. Het begint met 1 of 2 aanvallen waarna men volledig herstelt. Er treedt geen verergering op in de tijd maar er zijn gevallen bekend waarbij patiënten na 10-15 jaar evolueren naar de progressieve stadia van MS.
2. Relapse-remitting MS (zie figuur 1.7.2) : ongeveer 85% van de patiënten lijdt hieronder. Het is het meest voorkomende beginstadium van MS. Tijdens de aanvallen zullen bestaande symptomen verergeren of nieuwe symptomen opduiken. De duur van deze aanvallen kan variëren van dagen tot maanden. Meestal is er een gedeeltelijk tot volledig herstel en treedt er remissie (perioden zonder klinische symptomen) op. Klinisch gezien kan het een tijdje duren vooralleer een nieuwe aanval optreedt, maar misleidend genoeg zal het ziekteproces zich verder blijven ontwikkelen tijdens deze latente periode. De ziekte kan evolueren naar een secundair-progressieve fase.
3. Secundaire progressieve MS (zie figuur 1.7.3): bij 40% van de patiënten met een relapse-remitting MS zal het ziektepatroon veranderen naar deze vorm. Hierbij zijn de klinische aanvallen minder uitgesproken en lijkt de remisie te verdwijnen, dus herstel van de aanvallen gebeurt steeds minder goed. Geleidelijk nemen de tekorten en het ongemak van de patiënt toe.
4. Primair progressieve MS (zie figuur 1.7.4): hierbij zijn er voornamelijk motorische dysfuncties (bv. moeilijkheden bij het wandelen) waar te nemen. Er zijn geen echte ``aanvallen'' meer zoals in de bovenstaande gevallen, maar er is wel een continue neerwaartse progressie. Deze vorm komt bij 12% van de patiënten voor.

1.3.4 MS en TMEV

Over de oorzaak van MS is weinig geweten (zie sectie 1.3.2), daarom bestudeert men een aantal diermodellen omdat deze de situatie bij MS-patiënten simuleren. De belangrijkste diermodellen voor deze studie zijn het Experimentele Allergische Encefalitis of EAE en het Theiler's Murine Encefalomyelitis Virus of TMEV. Vermits in deze thesis experimenten met het TMEV worden gedaan zal dit diermodel kort toegelicht worden [16,31]. Men gebruikt TMEV voor de studie van MS omdat [33]:

• Het virus enkel aanwezig is ter hoogte van de witte stof in de demyeliniserende fase.
• De myelineafbraak gepaard gaat met mononucleaire inflammatie, die rijk aan macrofagen en immunogemedieerd is. Bij de DA-stam lijken voornamelijk CD$8^+$-cellen een rol te spelen, terwijl dat bij de BeAn-stam voornamelijk de CD$4^+$-cellen zijn [16,56]. Deze myelineafbraak -die ook bij MS optreedt- gebeurt via ``stripping'' van de myelinelamellen door de infiltrerende macrofagen of via vesiculaire degeneratie van myeline t.g.v. de aanwezigheid van geactiveerde mononucleaire cellen [15].
• Demyelinisatie in een klinische ziekte van het CZS (bv. spastische paralyse) resulteert.
• Deze demyeliniserende ziekte onder multigenische controle staat (zowel MHC- als non-MHC-genen).

Een verschil tussen het TMEV-diermodel en MS is dat men bij het diermodel de oorsprong van de antigenen kent. In een eerste fase zijn deze afkomstig van het virus zelf. Daarna migreren de virusspecifieke Th1-cellen naar het CZS, waar ze chemokines en pro-inflammatoire cytokines vrijlaten bij contact met de microglia. Deze raken dan geactiveerd en zorgen voor de aantrekking en de activatie van monocyten en macrofagen, die de myeline vernietigen door hun fagocytotische activiteit en door de productie van pro-inflammatoire cytokines, NO, zuurstofradicalen enz [31]. Waarschijnlijk worden er op die manier antilichamen gevormd tegen myelinecomponenten zoals het Myelin Basic Protein, het ProteoLipid Protein en het Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein [56,31].

1.4 Doelstelling

In deze thesis gaan we het effect van de temperatuur op de morfogenese na. Anders gezegd, we gaan na wat het effect van de temperatuur is op de vorming van de virale partikels, om volgende vragen te kunnen beantwoorden:

1. Is er een invoed van de temperatuur op de hoeveelheid gevormde partikels ?
2. Is er een invloed van de temperatuur op de aard van de gevormde partikels ?

De bedoeling is om uiteindelijk een temperatuur aan te wijzen waarbij de opbrengst aan virale en subvirale partikels het grootst is. Dit is belangrijk omdat er een probleem was om voldoende precursormateriaal te genereren na infectie met de GDVII-stam. De bekomen resultaten zouden dan als referentie kunnen dienen voor verder onderzoek op de GDVII-stam. Dat de temperatuur wel degelijk een effect op de morfogenese kan hebben, heeft men gezien bij infectie van Xenopus oöcyten met de GDVII-stam van het TMEV. Bij 30^C werd er hier een grote hoeveelheid precursormateriaal gevormd, i.t.t. experimenten op L-929 cellen uitgevoerd bij 37^C [20]. Ook bij het poliovirus bleek de temperatuur een invloed op de morfogenese te hebben: bij 34^C werd er meer precursorsmateriaal gevormd dan bij 32^C [38].