3. Resultaten

3.1 Aanmaak van radioactief referentiemateriaal

3.1.1 Doel

We maken referentiemateriaal aan dat als controle zal dienen bij de volgende proeven.

3.1.2 Werkwijze

Voor de aanmaak van het radioactief referentiemateriaal infecteerden we de L-929 cellen (2.27 x $10^7$ cellen per petrischaal) met de DA-stam van het TMEV aan 2.5 pfu/cel waarna we het virus gedurende 1 uur bij 37^C lieten adsorberen. De cellen van één petrischaal werden niet geïnfecteerd, maar ze werden wel analoog aan de geïnfecteerde monsters behandeld. (Deze petrischaal werd als niet-geïnfecteerde controle gebruikt.) Na deze adsorptiefase (bij 37^C en 5% $CO_2$) werden de cellen op een methionine-vrij medium geplaatst (zie sectie 2.3) en opnieuw in de incubator (bij 37^C en 5% $CO_2$) gezet. Bij het optreden van het cytopathogeen effect (CPE) op 5 uur post-infectie (p.i.) werd het isotoop, $^{35}$S L-methionine (zie sectie 2.3), toegevoegd waarna de cellen op verschillende tijdstippen (op 7 uur, 10 uur en 24 uur p.i.) gelyseerd werden. De gemerkte niet-geïnfecteerde cellen werden op 24 uur p.i. gelyseerd. Aangezien het CPE op 5 uur p.i. optrad, had het isotoop respectievelijk 2 uur, 5 uur en 19 uur de tijd gehad om te incorporeren in (virale) proteïnen. Deze tijden (2 uur, 5 uur en 19 uur) worden pulstijden genoemd.

Table 3.1: Overzicht van de monsters voor de aanmaak van het referentiemateriaal.

Aard van het monster

Pulstijd (uur)

gradiënt 1

Het niet-geïncorporeerde isotoop werd verwijderd via 7 dialyserondes (zie sectie 2.5). Daarna werden de monsters (4 + 2 additionele monsters (zie tabel 3.1)) onderworpen aan 5-30% en 15-30% sucrose gradiënt ultracentrifugatie (SGU). Bij de 15-30% gradiënt bevatte het eerste additionele monster radioactieve 160S virionen. Deze 160S virionen zijn afkomstig van de fracties van een virionpiek die verzameld werden na SGU. Deze virionen worden bijgevolg als referentiemateriaal bij SGU, immunoprecipitatie of SDS-PAGE gebruikt. Het andere monster bevatte ook 160S materiaal maar dit werd blootgesteld aan 40^C gedurende 20 minuten. Deze temperatuur werd gekozen om na te gaan of er misschien 80S intermediairen gevormd konden worden. Immers, bij het TMEV vormen zich na blootstelling gedurende 20 minuten aan 56^C 14S afbraakpartikels, terwijl dat bij het poliovirus 80S lege capsiden zijn. Omdat een lagere temperatuur misschien minder destructief werkt, werd nagegaan of er bij het TMEV bij deze lagere temperatuur (40^C) 80S afbraakpartikels gevormd konden worden. De 2 additionele monsters bevatten in het geval van de 5-30% gradiënt 160S materiaal dat voor het eerste monster gedegradeerd werd door het gedurende 20 minuten te verwarmen bij 56^C zodat 14S afbraakpartikels ontstonden, die als referentie fungeren voor de 5-30% SGU. Het tweede monster -eveneens bestaande uit 160S virionen- werd blootgesteld aan 40^C, om na te gaan of een verlaging in temperatuur een effect had op het genereren van de afbraakpartikels.

Na sucrose gradiënt ultracentrifugatie werden sommige monsters (gepulst bij 2 uur, 5 uur en 19 uur; het niet-geïnfecteerde gepulst op 19 u) onderworpen aan immunoprecipitatie om met verhoogde gevoeligheid de virale en subvirale partikels op te sporen. Voor de 15-30% gradiënten waren dat de pulstijden 2 uur en 5 uur, voor de 5-30% waren dat de pulstijden 5 uur en 19 uur, en de controle. Daar waar het nuttig werd geacht, werden sommige monsters na immunoprecipitatie aan SDS-PAGE onderworpen.

3.1.3 Resultaten

3.1.3.1 Resultaten van de 15-30% sucrose gradiënt ultracentrifugatie

Figure 3.1: Profiel van het 160S materiaal (controle) na 15-30% SGU, zonder immunoprecipitatie.

Figure 3.2: Profiel van de pulstijd 19 uur na 15-30% na SGU, zonder immunoprecipitatie.

Figure 3.3: Profiel van de pulstijd 5 uur na 15-30% na SGU, zonder immunoprecipitatie.

Figure 3.4: Profiel van de pulstijd 5 uur na 15-30% SGU, na immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van het 160S materiaal gedegradeerd gedurende 20 minuten bij 40^C na 15-30% SGU, zonder immunoprecipitatie.

3.1.3.2 Bespreking van de resultaten van de 15-30% sucrose gradiënt ultracentrifugatie

Op de grafiek van het referentiemateriaal (zie figuur 3.1), is een duidelijke piek zichtbaar t.h.v. fracties 17 tot 22 . Dit is de normale plaats van sedimentatie voor virionen.

Op 24 uur p.i. (= puls 19 uur) is er na sucrose gradiënt ultracentrifugatie (SGU) een verhoging waarneembaar t.h.v. de fracties 19-20 (zie figuur 3.2), die te wijten is aan de sedimentatie van 160S virionen. Er werd hier geen immunoprecipitatie uitgevoerd omdat zich al een duidelijke virionpiek aftekende na SGU.

Op 10 uur p.i. (i.e. na een puls van 5 uur) is er enkel t.h.v. de top van de gradiënt (zonder immunoprecipitatie) een piek zichtbaar (zie figuur 3.3). Deze piek bevat naast viraal materiaal ook cellulaire proteïnen en is altijd aanwezig. De 160S virionpiek is hier niet rechtstreeks zichtbaar omdat de morfogenese tot virionen op dit tijdstip nog maar net gestart is en omdat de hoeveelheid gevormde virionen bij gevolg nog te klein is om zonder immunoprecipitatie te detecteren.

Na immunoprecipitatie kunnen ook hier 160S virionen waargenomen worden (zie piek t.h.v. fracties 18 tot 21: figuur 3.4).

Op 7 uur p.i. ( i.e. na 2 uur pulsen) konden nog geen virionen waargenomen worden, ook niet na immunoprecipitatie (resultaten niet weergegeven). Dit is te wijten aan het feit dat we hier op 7 u p.i. zijn, terwijl de replicatiecyclus van het TMEV 10 uur duurt. D.w.z. dat er op dit moment nog geen virionen gevormd worden.

Men kon overigens bij geen van de monsters een 80S piek waarnemen. Deze piek vindt men echter wel terug na 15-30% SGU van de GDVII-stam van het TMEV [50].

Bij het niet-geïnfecteerde monster was er -zoals verwacht- geen virale 160S piek zichtbaar (resultaten niet weergegeven).

Op de grafiek van het referentiemateriaal dat gedurende 20 minuten 40^C verwarmd werd, was er noch een 160S virionpiek, noch een 80S piek aanwezig (zie figuur 3.5). Dit wijst erop dat bij een verlaging van de normale degradatietemperatuur van 56^C naar 40^C de 160S virionen niet uiteenvallen naar 80S intermediairen, maar eveneens naar kleinere partikels (zie figuur 3.6 en figuur 3.7).

3.1.3.3 Resultaten van de 5-30% sucrose gradiënt ultracentrifugatie

Figure: Profiel van het gedegradeerd 160S materiaal bij 5-30% SGU, zonder immunoprecipitatie na degradatie bij 56^C.

Figure: Profiel van het gedegradeerd 160S materiaal na 5-30% SGU, zonder immunoprecipitatie na degradatie bij 40^C.

Figure 3.8: Profiel van de pulstijd 19 uur na 5-30% SGU, zonder immunoprecipitatie.

Figure 3.9: Profiel van de pulstijd 19 uur na 5-30% SGU na immunoprecipitatie.

Figure 3.10: SDS-PAGE van het monster gepulst op 19 uur. Resultaat na immunoprecipitatie bij een 5-30% SGU: lanen 1 t.e.m. 14: fracties 1 t.e.m. 14 van de gradiënt; lanen 16 t.e.m. 29: fracties 15 t.e.m. 28 van de gradiënt; lanen 15 en 30: 160S DA-referentiemateriaal.

(a)

Figure 3.11: Profiel van de pulstijd 5 uur na 5-30% SGU, zonder immunoprecipitatie.

Figure 3.12: Profiel van de pulstijd 5 uur na 5-30% SGU, na immunoprecipitatie.

Figure 3.13: SDS-PAGE van het monster gepulst op 5 uur. Resultaat na immunoprecipitatie bij een 5-30% SGU: lanen 1 t.e.m. 14: fracties 1 t.e.m. 14 van de gradiënt; lanen 16 t.e.m. 29: fracties 15 t.e.m. 28 van de gradiënt; lanen 15 en 30: 160S DA-referentiemateriaal.

(a)

Figure 3.14: Profiel van het niet-geïnfecteerde monster gepulst op 19 uur na 5-30% SGU, zonder immunoprecipitatie.

3.1.3.4 Bespreking van de resultaten van de 5-30% sucrose gradiënt ultracentrifugatie

Daar waar bij de 15-30% sucrose gradiënten 160S virionen gebruikt werden als referentiemateriaal, wordt bij de 5-30% sucrose gradiënten gebruik gemaakt van 14S pentameren die normaal bekomen worden door 160S virionen gedurende 20 minuten te verwarmen bij 56^C. Deze sedimenteren t.h.v. fracties de 14 t.e.m. 18 (zie figuur 3.6). Worden 160S virionen i.p.v. bij 56^C bij 40^C verwarmd, dan worden pentameren gevormd (fracties 14 t.e.m. 20: zie figuur 3.7). Als we dan de hoeveelheid gedegradeerde 14S partikels bekomen op deze 2 temperaturen vergelijken dan was de opbrengst 1.4 keer hoger bij 40^C. Waarschijnlijk zorgt de daling in temperatuur voor een minder destructief effect op de gevormde 14S partikels die bij hogere temperatuur nog tot kleinere 5S partikels worden afgebroken. Men kan 14S afbraakmateriaal onderscheiden van het opbouwmateriaal door de proteïnensamenstelling na te gaan. De opbouwpartikels bestaan uit VP0, VP1 en VP3 terwijl de afbraakpartikels uit VP1, VP2, VP3 en VP4 bestaan (doordat deze gevormd worden na de maturatieklieving).

Op 19 uur na het begin van het cytopathogeen effect (= 24 uur p.i.) zien we een piek met maximum op fractie 5 zonder immunoprecipitatie (ize figuur 3.8) . Deze piek is het resultaat van de sedimentatie van zowel cellulaire als virale proteïnen. De verhoging t.h.v. fractie 17 wijst op de aanwezigheid van 14S pentameren. Dit werd bevestigd door immunoprecipitatie waarbij er zich een 5S piek met maximum op fractie 7 en een duidelijk piek t.h.v. fracties 16 tot 19 aftekende (zie figuur 3.9). Deze piek bestaat hoofdzakelijk 14S afbraakmateriaal. Dit werd bevestigd door SDS-PAGE (zie figuur 3.10). We zien t.h.v. lanen 18 en 19 een duidelijke aanwezigheid van 14S materiaal. Hoewel hier de VP0 band aanwezig is, is de intensiteit van deze band zeer laag. Dit i.t.t. de VP1, VP2, VP3 proteïnenbanden die veel sterker in intensiteit zijn. Hieruit kunnen we besluiten dat dit 14S materiaal voornamelijk uit afbraakmateriaal bestaat (hoewel er toch in geringe mate opbouwpartikels aanwezig zijn). T.h.v. de laatste lanen is de intensiteit gestegen. Dit is te wijten aan de sedimentatie van virionen op deze fracties bij de 5-30% SGU. Ook hier is er een VP0 band aanwezig. De partikels die hier aanwezig zijn, zjin waarschijnlijk provirionen.

Na 5 u pulsen (= 10 uur p.i.) is er eveneens een heterogene piek met maximum op fractie 5 en een lichte verhoging t.h.v. fractie 21 zichtbaar (zonder immunoprecipitatie) (zie figuur 3.11). Op deze positie sedimenteren 20S partikels, die o.a. werden waargenomen bij de GDVII-stam van het TMEV. Om te weten of deze piek van cellulaire of virale oorsprong was, hebben we dit monster aan immunoprecipitatie onderworpen. Omdat we dit 20S materiaal d.m.v. immunoprecipitatie niet konden neerslaan, volgde hieruit dat het geen viraal materiaal maar wel materiaal van cellulaire oorsprong betrof. De 5S en 14S precursorpieken waren daarentegen wel aanwezig (zie figuur 3.12). Na deze immunoprecipitatie werd er ter bevestiging nog een SDS-PAGE uitgevoerd op elke fractie (zie figuur 3.13). Hierbij werden de virale proteïnen (VP1 en VP3) van 14S precursoren teruggevonden, evenals een precursorproteïnenband t.h.v. fracties 6 t.e.m. 8. Een ander eigenaardig verschijnsel was dat er bij deze pulstijd al VP2 proteïnen aanwezig waren. Vermits VP2 enkel verschijnt als de maturatieklieving al is opgetreden, is dit materiaal afbraakmateriaal.

De puls van 2u (= 7 uur p.i.) onthulde opnieuw een kleine verhoging t.h.v. fractie 21 zonder immunoprecipitatie (resultaat niet weergegeven). Deze verhoging was ook waarneembaar in het niet-geïnfecteerde monster (zie figuur 3.14). Hieruit kan men besluiten dat het om cellulair en niet om viraal materiaal gaat.

3.2 Invloed van de temperatuur op de morfogenese

3.2.0.1 Doel

Het doel van dit experiment is nagaan of de temperatuur al dan niet een effect op de morfogenese heeft, m.a.w. is de vorming van subvirale en virale partikels aan een temperatuurseffect onderhevig? We gaan na of zo'n effect optreedt door L-929 cellen te infecteren met de DA-stam van het TMEV en de morfogenese bij verschillende temperaturen te volgen. Daartoe lyseren we de cellen op verschillende tijdstippen na het toedienen van het isotoop, zodat we de vorming van de diverse virale partikels: precursorpartikels (bij pulstijd 2u), virionen (bij pulstijd 5u) en afbraakpartikels (bij pulstijd 19u) kunnen bestuderen en vergelijken bij de verschillende temperaturen. In een eerste experiment bestudeerden we de morfogenese bij 32^C, 34^C en 36^C. Daarna verbreden we het temperatuursinterval, en onderzoeken we de virusmaturatie bij 30^C, 34^C en 37^C.

3.2.1 Studie van de morfogenese bij 32^C, 34^C en 36^C

3.2.1.1 Werkwijze

We infecteren L-929 cellen (1,21.$10^6$ cellen per petrischaal) aan 8 pfu/cel met de DA-stam van het TMEV (1.$10^8$ pfu/ml) en plaatsen de petrischalen gedurende 1 uur in de incubator bij 5% $CO_2$ druk bij een temperatuur van 36^C. Daarna voorzien we de cellen van methioninevrij medium (zie sectie 2.3) en wachten totdat het CPE optreedt. Op 5 uur p.i. (bij het begin van het CPE) werd het $^{35}S$ L-methionine aan de cellen toegevoegd. Op 7 uur, 10 uur en 24 uur p.i. lyseerden we de cellen. Deze tijdstippen komen overeen met de pulstijden 2 uur, 5 uur en 19 uur. Het niet-geïncorporeerde isotoop verwijderen we daarna d.m.v. dialyse (zie sectie 2.5). Daarna werden de monsters onderworpen aan ultracentrifugatie doorheen een 15-30% en een 5-30% sucrose gradiënt (zie sectie 2.6). Op de meeste monsters werd een immunoprecipitatie (zie sectie 2.7) met MAb (anti-VP1) uitgevoerd. Sommige monsters werden na immunoprecipitatie nog onderworpen aan SDS-PAGE (zie sectie 2.8).

3.2.1.2 Resultaten van de 15-30% sucrose gradiënt ultracentrifugatie

Figure: Profiel van de pulstijd 19 uur bij 32^C na 15-30% SGU, zonder immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van de pulstijd 19 uur bij 32^C na 15-30% SGU, na immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van de pulstijd 19 uur bij 34^C na 15-30% SGU, zonder immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van de pulstijd 19 uur bij 34^C na 15-30% SGU, na immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van de pulstijd 19 uur bij 36^C na 15-30% SGU, zonder immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van de pulstijd 19 uur bij 36^C na 15-30% SGU, na immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van de pulstijd 5 uur bij 32^C na 15-30% SGU, na immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van de pulstijd 5 uur bij 34^C na 15-30% SGU, na immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van de pulstijd 5 u bij 36^C na 15-30% SGU, na immunoprecipitatie.

3.2.1.3 Bespreking van de resultaten van de 15-30% sucrose gradiënt ultracentrifugatie

Om de hoeveelheid geproduceerde virionen met elkaar te kunnen vergelijken bij verschillende temperaturen en pulstijden, berekenden we het percentage gevormde virionen. Dit percentage werd bekomen door de radioactiviteit van de virionpiek te delen door de totale radioactiviteit van de gradiënt en te vermenigvuldigen met 100 (zie tabel 3.2).

% gevormd virus = $\frac{c.p.m. viruspiek}{totaal c.p.m. gradiënt}$ x 100

Bij een pulstijd van 19 uur zien we zonder immunoprecipitatie al een viruspiek (160S) met maximum t.h.v. fractie 19 (zie pijlen op figuren 3.15, 3.17 en 3.19).

Na immunoprecipitatie zien we dat de virionpieken veel duidelijker zichtbaar zijn, vergeleken met de metingen zonder immunoprecipitatie. Dit is normaal omdat we d.m.v. immunoprecipitatie specifiek de virale partikels neerslaan. De verhoudingen van de radioactiviteit van de virionpieken t.o.v. de totale radioactiviteit bedragen hier voor de opeenvolgende temperaturen resp. 19%, 44% en 32%. De opbrengst aan virionen is dus het grootst bij 34^C, gevolgd door 36^C. Bij 32^C wordt het kleinste aantal virionen gevormd.

Bij de pulstijd van 5 uur werden geen viruspieken waargenomen zonder immunoprecipitatie (resultaten niet weergegeven). Daarom werden de monsters aan een immunoprecipitatie onderworpen. De resultaten zijn weergegeven in de figuren 3.21, 3.22 en 3.23. Hierbij bedraagt de opbrengst aan 160S virionen bij de 3 verschillende temperaturen resp. 0%, 9%, 6%. Deze lage percentages zijn te wijten aan het feit dat er op 10 uur p.i. nog niet veel virionen geproduceerd zijn omdat de assemblage tot virionen nog niet lang bezig is.

Bij de pulstijd van 2 uur was er bij geen van de temperaturen rechtstreeks (zonder immunoprecipitatie) een 160 piek waarneembaar. I.t.t. de pulstijd van 5 uur was er echter na immunoprecipitatie ook geen virionpiek aanwezig (resultaten niet weergegeven). Dit kan men verklaren door het feit dat op 7 uur p.i. er nog geen virionen gevormd zijn omdat de replicatiecyclus 10 uur duurt.

3.2.1.4 Resultaten van de 5-30% sucrose gradiënt ultracentrifugatie

Figure: Profiel van de pulstijd 19 uur bij 32^C na 5-30% SGU, zonder immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van de pulstijd 19 uur bij 32^C na 5-30% SGU, na immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van de pulstijd 19 u bij 34^C na 5-30% SGU, zonder immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van de pulstijd 19 u bij 34^C na 5-30% SGU, zonder immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van de pulstijd 19 uur bij 36^C na 5-30% SGU, zonder immunoprecipitatie.

Figure: SDS-PAGE van de monsters gepulst voor 19 uur bij 34^C (a en b) en 36^C (c en d). Resultaat na immunoprecipitatie en 5-30% SGU: lanen 1 tot 14: fracties 1 tot 14 van de gradiënt; lanen 16 tot 29: fracties 15 tot 28 van de gradiënt; lanen 15 en 30: 160S DA-referentiemateriaal.

1

(a)

Figure: Profiel van de pulstijd 19 uur bij 36^C na 5-30% SGU, na immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van de pulstijd 5 uur bij 32^C na 5-30% SGU, zonder immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van de pulstijd 5 uur bij 32^C na 5-30% SGU, na immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van de pulstijd 5 uur bij 34^C na 5-30% SGU, zonder immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van de pulstijd 5 uur bij 34^C na 5-30% SGU, na immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van de pulstijd 5u bij 36^C na 5-30% SGU, zonder immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van de pulstijd 5 uur bij 36^C na 5-30% SGU, na immunoprecipitatie.

Figure: SDS-PAGE van de monsters gepulst voor 5 uur bij 36^C. Resultaat na immunoprecipitatie en 5-30% SGU: lanen 1 tot 14: fracties 1 tot 14 van de gradiënt,

(a)

lanen 16 tot 29: fracties 15 tot 28 van de gradiënt; lanen 15 en 30: 160S DA-referentiemateriaal.

Table 3.2: Overzicht van de relatieve hoeveelheden (%) 160S virionen en 14S partikels gedetecteerd bij de verschillende temperaturen na immunoprecipitatie resp. bij 15-30% en 5-30% SGU.

32^C

34^C

36^C

pulstijd 19 u (15-30%)

3.2.1.5 Bespreking van de resultaten van de 5-30% sucrose gradiënt ultracentrifugatie

Bij een pulstijd van 19 uur (24 uur p.i.) zien we een grote piek met maximum t.h.v. fractie 4-5 (zonder immunoprecipitatie) (zie figuren 3.24, 3.26 en 3.28). Na immunoprecipitatie is deze piek praktisch niet meer waarneembaar. Dit wijst erop dat deze piek voornamelijk het resultaat is van de sedimentatie van cellulair en/of niet structureel viraal materiaal. Slechts een uiterst gering percentage van deze piek is toe te schrijven aan de sedimentatie van 5S protomeren. Wel is er na immunoprecipitatie een duidelijke 14S piek zichtbaar t.h.v. fracties 15-19 bij de 3 temperaturen (zie figuur 3.25, 3.18 en 3.30). De procentuele opbrengst aan 14S pentameren bij de 3 temperaturen bedraagt na immunoprecipitatie: 7%, 13%, 15%. Bij een temperatuur van 36^C vindt men meer 14S afbraakpartikels (bestaande uit VP1, VP2, VP3, VP4) terug dan bij 34^C, waar men dan weer meer 14S partikels terugvindt vergeleken met 32^C. Dit lijkt tegenstrijdig met de resultaten van de 15-30% SGU: de hoeveelheid virionen gevormd bij 34^C is groter dan deze bij 36^C. Ook hieruit blijkt dat een hogere temperatuur voor een verhoogde afbraak van virionen tot 14S afbraakpartikels zorgt.

De monsters van pulstijd 19 uur bij 34^C en 36^C werden na immunoprecipitatie aan SDS-PAGE onderworpen (zie figuur 3.29). T.h.v. de lanen 16 t.e.m. 18 vinden we 14S partikels terug. Deze blijken voornamelijk uit VP1, VP2, VP3 te bestaan, wat erop wijst dat een groot deel van deze 14S partikels, afbraakpartikels zijn. De intensiteit van deze 14S proteïnenbanden bij 34^C is lager dan de intensiteit bij 36^C. Hieruit volgt dat er inderdaad meer afbraakmateriaal aanwezig is bij 36^C vergeleken met 34^C. Er is echter ook een -hele lichte- VP0 band waaruit we besluiten dat er ook nog een aantal opbouwpartikels (die bestaan uit VP0, VP1, VP3) aanwezig zijn. Ook hier vindt men bij de laatste lanen provirionen (aanwezigheid van VP0) en 160S virionen.

Bij de pulstijd van 5 uur (zie figuren 3.31 t.e.m. 3.36) en de pulstijd van 2 uur (resultaten niet weergegeven) zagen we een eigenaardig fenomeen. Er werden geen of nagenoeg geen discrete pieken van 5S precursorpartikels en 14S precursorpartikels waargenomen. In plaats daarvan strekte zich een verhoogde radioactiviteit uit tussen de fracties 7-14. Dit is in tegenstelling tot de bevindingen uit sectie 3.1.3, waar we met dezelfde procedure, dezelfde virusstam en dezelfde cellijn, wel 5S en 14S partikels konden waarnemen. Om de hypothese na te gaan of de verhoogde radioactiviteit t.h.v. de fracties 7 tot 14 te wijten is aan de sedimentatie van een tot dusver onbekend viraal partikel of aan achtergrondradioactiviteit, werd het monster gepulst op 5 uur bij 36^C onderworpen aan SDS-PAGE (zie figuur 3.37). Indien het om een tot dusver onbekend viraal partikel zou gaan, zullen we als bewijs daarvan virale proteïnen waarnemen t.h.v. de bovenste lanen. Indien het om ruis (achtergrondradioactiviteit) zou gaan, zullen we deze virale proteïnen niet terugvinden. Omdat er geen virale structurele proteinen konden worden waargenomen kan de hyupothese dat de verhoogde radioactiviteit een gevolg is van de sedimenatie van een niew viraal intermediair worden uitgesloten. Het betreft hier achtergrondruis vnl te wijten aan de aanwezigheid van een bepaald (cellulair) proteïne (zie pijl figuur 3.37). De aanwezigheid van een proteïne dat door het MAb (anti-VP1) wordt herkend kan belangrijk zijn bij het onderzoek naar de patholgie die het virus veroorzaakt: antilichamen worden op die manier niet enkel tegen het virus, maar ook tegen een cellulair proteïne gemaakt, zodat een auto-immuun reactie op gang kan komen (zie sectie 3.3).

3.2.2 Studie van de morfogenese bij 30^C, 34^C en 37^C

Vermits er in bovenstaand experiment een effect van de temperatuur zichtbaar was op de gevormde hoeveelheden virionen en 14S afbraakpartikels, werd besloten om een breder temperatuursinterval (30^C, 34^C en 37^C) te kiezen, enerzijds om het effect van de temperatuur te bevestigen en anderzijds om vooralsnog 5S en 14S opbouwprecursoren waar te nemen. We hebben nog een extra pulstijd ingevoerd, nl. 8 uur omdat dat misschien wat meer duidelijkheid zou brengen over het niet detecteren van de 5S en de 14S opbouwpartikels.

3.2.2.1 Werkwijze

L-929 cellen (3,130. $10^6$ cellen/petrischaal) werden geïnfecteerd met 3 pfu/cel van de DA-stam van het TMEV (1.$10^8$ pfu/ml). Daarna werden de petrischalen gedurende 1 uur in de incubator geplaatst bij 5% $CO_2$ druk en bij 34^C, omdat de hoeveelheid gevormde 160S virionen bij deze temperatuur het hoogst was. Dit werd gedaan om er zeker van te zijn dat de adsorptie van het virus aan de gastheercel niet aan een temperatuurseffect onderhevig zou zijn. Na het methioninevrij medium op de petrischalen gebracht te hebben, plaatsten we de petrischalen in 3 incubatoren met respectievelijke temperaturen 30^C, 34^C en 37^C. Het CPE trad op op 6 uur p.i. waarna de cellen op 8 uur, 11 uur, 14 uur en 25 uur p.i. gelyseerd werden. Dit komt overeen met een pulstijd van resp. 2 uur, 5 uur, 8 uur en 19 uur (na het CPE). Na 6 dialyserondes was het niet-geïncorporeerde isotoop verwijderd en werden de verschillende monsters aan SGU onderworpen. Na SGU werd op elk monster nog een immunoprecipitatie uitgevoerd.

3.2.2.2 Resultaten van de 15-30% sucrose gradiënt ultracentrifugatie

Figure: Profiel van de pulstijd 19 uur bij 30^C na 15-30% SGU, zonder immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van de pulstijd 19 uur bij 30^C na 15-30% SGU, na immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van de pulstijd 19 uur bij 34^C na 15-30% SGU, zonder immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van de pulstijd 19 uur bij 34^C na 15-30% SGU, na immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van de pulstijd 19 uur bij 37^C na 15-30% SGU, zonder immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van de pulstijd 19 uur bij 37^C na 15-30% SGU, na immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van de pulstijd 8 uur bij 30^C bij 15-30% SGU, na immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van de pulstijd 8 uur bij 34^C bij 15-30% SGU, na immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van de pulstijd 8 uur bij 37^C bij 15-30% SGU, na immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van de pulstijd 5 uur bij 30^C bij 15-30% SGU, na immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van de pulstijd 5 uur bij 34^C bij 15-30% SGU, na immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van de pulstijd 5 uur bij 37^C bij 15-30% SGU, na immunoprecipitatie.

Table 3.3: Overzicht van de relatieve opbrengst (%) van 160S virionen en 14S partikels gedetecteerd bij de verschillende temperaturen na immunoprecipitatie en bij resp. 15-30% en 5-30% SGU

30^C

34^C

37^C

pulstijd 19 uur (15-30%)

3.2.2.3 Bespreking van de resultaten van de 15-30% sucrose gradiënt ultracentrifugatie

Bij de pulstijd van 19 uur is er zowel voor immunoprecipitatie, als na immunoprecipitatie geen virionpiek zichtbaar bij 30^C (zie figuur 3.38 en 3.39). Bij 34^C was er na rechtstreekse telling van het monster eveneens geen virionpiek zichtbaar (zie figuur 3.40), maar wel na immunoprecipitatie (zie figuur 3.41). Deze piek met maximum op fractie 20 bleek minder (24%) virionen te bevatten dan het geval was bij het vorige experiment (42%) bij dezelfde temperatuur (zie tabel 3.3 en sectie 3.2.1).

Ook bij 37^C ziet men geen virionpiek zonder immunoprecipitatie (zie figuur 3.42), terwijl deze piek wel zichtbaar wordt na immunoprecipitatie (zie figuur 3.43). Het percentage aan virionen bedroeg hier 18%. De vaststelling uit het voorgaande experiment dat bij 34^C meer virionen aanwezig zijn dan bij 36^C geldt hier ook: bij 34^C worden er meer virionen gevormd dan bij 37^C. Het verschil in hoeveelheid gevormde virionen tussen 34^C en 37^C is hier wel minder uitgesproken danbij het voorgaande experiment. Dit verschijnsel kan te wijten zijn aan het feit dat er meer cellen in de petrischaal aanwezig waren, vergeleken met het vorige temperatuursexperiment. Hierdoor zou het kunnen dat de cellen hun metabolisme reduceren omdat alle beschikbare oppervlakte is ingenomen. Omdat virussen gebruik maken van de cellulaire replicatiemechanismen zou hierdoor misschien geen optimale virusproductie tot stand kunnen komen. Een lagere temperatuur blijkt dus opnieuw beter te zijn om meer virionen te bekomen of te behouden. Anderzijds mag de temperatuur ook niet te laag zijn omdat er dan geen virionen meer gevormd worden.

Ook bij de pulstijd van 8 uur (= 14 uur p.i.) is er bij de rechtstreekse tellingen na SGU geen viruspiek zichtbaar (resultaten niet weergegeven). Dit is ook het geval na immunoprecipitatie bij 30^C (zie figuur 3.44), i.t.t. de kleine virionpiek die bij 34^C na immunoprecipitatie zichtbaar is (zie pijl figuur 3.45). Procentueel gezien, bevat deze 160S piek bij 34^C 13% van de totale radioactiviteit, terwijl dat bij 37^C 12% bedraagt (zie figuur 3.46). Bij de pulstijden van 8 uur en 5 uur is er in beide gevallen slechts een gering verschil tussen de opbrengst aan virionen bij 34^C en 37^C (i.t.t. de pulstijd van 19 uur). Daaruit zou men kunnen besluiten dat een langere blootstelling bij hogere temperatuur noodzakelijk is om virionen te degraderen.

Bij de drie temperaturen (30^C, 34^C en 37^C) van pulstijd 5 uur (= 11 uur p.i.) is er na SGU geen virionpiek te zien, terwijl dat wel het geval is bij 34^C en 37^C na immunoprecipitatie. Bij 30^C blijft ook na immunoprecipitatie de virionpiek afwezig. Uit de gegevens van de procentuele opbrengst blijkt dat beide pieken ongeveer even groot zijn : resp 4.86% en 4.79%. De cijfers zijn hier weer niet zo hoog omdat de morfogenese tot virionen nog maar net gestart is (zie ook voorgaande experiment).

Bij puls 2 uur is er in geen van de gevallen een 160S piek zichtbaar (resultaten niet weergegeven). Dit is te wijten aan het feit dat het nog te vroeg in de replicatie is om al virionen terug te vinden.

3.2.2.4 Resultaten van de 5-30% sucrose gradiënt ultracentrifugatie

Figure: Profiel van de pulstijd 19 uur bij 30^C bij 5-30% SGU, zonder immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van de pulstijd 19 uur bij 30^C bij 5-30% SGU, na immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van de pulstijd 19 uur bij 34^C bij 5-30% SGU, zonder immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van de pulstijd 19 uur bij 34^C na 5-30% SGU, na immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van de pulstijd 19 uur bij 37^C na 5-30% SGU, zonder immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van de pulstijd 19 uur bij 37^C na 5-30% SGU, na immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van de pulstijd 8 uur bij 30^C na 5-30% SGU, na immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van de pulstijd 8u bij 34^C na 5-30% SGU, na immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van de pulstijd 8 uur bij 37^C na 5-30% SGU, na immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van de pulstijd 5 uur bij 30^C na 5-30% SGU na immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van de pulstijd 5 uur bij 34^C na 5-30% SGU, na immunoprecipitatie.

Figure: Profiel van de pulstijd 5 uur bij 37^C na 5-30% SGU, na immunoprecipitatie.

3.2.2.5 Bespreking van de resultaten van de 5-30% sucrose gradiënt ultracentrifugatie

Bij de pulstijd van 19 uur is er op 30^C een piek t.h.v. fractie 5 waarneembaar, maar een 14S piek is niet zichtbaar. Dit geldt voor alle rechtstreekse tellingen bij deze temperatuur (zie figuur 3.50 en resultaten niet weergegeven). Bij 34^C is er na rechtstreekse telling van de fracties ook geen piek van pentameren zichtbaar (zie figuur 3.52), maar wel een 5S piek (zie figuur 3.53). Immunoprecipitatie geeft daarentegen een verhoging aan voor zowel de fracties 2 t.e.m. 6 als t.h.v. fracties 15 tot 18, dat de plaats voor de sedimentatie van pentameren is. De procentuele opbrengst aan 14S materiaal (zowel opbouw- als afbraak t.g.v. het late tijdstip) bedraagt 10%, wat lager is dan in het voorgaande experiment bij 34^C (13%), maar gelijk aan het percentage (10%) bekomen na immunoprecipitatie van het monster bij 37^C (zie figuur 3.55). Blijkbaar brengt een hogere temperatuur in dit geval niet mèèr 14S partikels op, zoals dat wel het geval was bij het eerste temperatuursexperiment. Bij 37^C kan men geen 14S piek waarnemen zonder immunoprecipitatie. Terwijls dit wel mogelijk wordt na immunoprecipitatie. Er is echter wel een piek met maximum op fractie 4 aanwezig (zie figuur 3.54).

Na 8 u pulsen is er zonder immunoprecipitatie bij 34^C (net als bij 30^C en 37^C) een grote piek zichtbaar t.h.v. fractie 5 (resultaten niet weergegeven). Deze piek bevat zoals in alle voorgaande gevallen naast het viraal materiaal ook cellulair materiaal. Na immunoprecipitatie is een verhoging zichtbaar met maximum op fractie 6 en een kleine verhoging t.h.v. fracties 17 en 18 (zie figuur 3.57). Dit komt overeen met de plaats van sedimentatie voor resp. 5S protomeren en 14S pentameren. Ook bij 30^C en bij 37^C (zie resp. figuur 3.56 en 3.58) zien we een 5S piek, hoewel de radioactiviteit zowel bij 30^C als bij 37^C kleiner is dan deze bij 34^C.

Bij de pulstijd van 5 uur (11 uur p.i.) is er na rechtstreekse telling enkel een grote piek t.h.v. fractie 5 zichtbaar bij de drie verschillende temperaturen (resultaten niet weergegeven). Na immunoprecipitatie is er bij deze drie temperaturen telkens een piek van 5S protomeren te zien (zie figuren 3.59, 3.60 en 3.61). Blijkbaar worden er bij deze pulstijd steeds 5S precursoren gevormd, maar zijn er geen 14S pentameren detecteerbaar. Dit kan te wijten zijn aan een snelle assembly van 14S pentameren in 160S virionen, zodat er geen piek van 14S pentameren detecteerbaar is.

Bij de pulstijd van 2 uur nam men dezelfde verhoogde radioactiviteit waar als in het vorige experiment (resultaten niet weergegeven). Daarom is het moeilijk om conclusies te trekken over de aanwezigheid van virale partikels daar hier op de rand van de gevoeligheid gewerkt wordt.

Hoe het komt dat deze temperatuursexperimenten zo verschillend zijn van de aanmaak van het referentiemateriaal werd niet duidelijk.

3.3 Onderzoek naar een cellulair proteïne aanwezig na immunoprecipitatie

3.3.1 Doel

Het doel van dit experiment was om na te gaan of het specifiek cellulair proteïne, dat zowel bij een niet-geïnfecteerd als een geïnfecteerd monster voorkomt na immunoprecipitatie, geen rol zou kunnen spelen in het pathologisch proces veroorzaakt door het virus. Dit is belangrijk omdat de antilichamen van de gastheer zowel het virus, als het cellulair proteïne zouden kunnen herkennen, kan er op die manier een auto-immuunreactie op gang komen t.g.v. de kruisreactie met dit cellulair proteïne.

3.3.2 Werkwijze

Table 3.4: Overzicht van de monsters onderworpen aan immunoprecipitatie. $Ab_t$ = antilichaam gericht tegen het VP1 van het TMEV; $Ab_{polio}$ = antilichaam gericht tegen het poliovirus

Ag (80 l)

Ab (10 l) 1

Er werden 5 monsters genomen uit niet-geïmmunoprecipiteerd niet-geïnfecteerd materiaal, gemaakt in sectie 3.1. Deze monsters werden samen met een geïnfecteerde controlemonster aan immunoprecipitatie onderworpen. Het MAb (anti-VP1) dat in deze immunoprecipitatie gebruikt werd, in verschillende concentraties gebruikt om op die manier de affiniteit van het antilichaam voor het cellulaire proteïne te bepalen (zie tabel 3.4). Het antilichaam gericht tegen het poliovirus (35 1F4) werd gebruikt om de specificiteit van de interactie tussen het proteïne en het antlichaam na te gaan. Daarna werden deze geïmmunoprecipiteerde monsters samen met één niet-geïmmunoprecipiteerd niet-geïnfecteerd monster aan SDS-PAGE onderworpen (zie figuur 3.62).

Figure 3.62: Resultaten van de SDS-PAGE: laan 1:niet-geïnfecteerd celextract zonder antilichaam; laan 2: niet-geïnfecteerd celextract met 1/10 verdund antilichaam gericht tegen het TMEV; laan 3: niet-geïnfecteerd celextract met 1/100 verdund antilichaam gericht tegen het TMEV; laan 4: niet-geïnfecteerd celextract met 1/1000 verdund antilichaam gericht tegen het TMEV; laan 5: niet-geïnfecteerd celextract met 1/100 verdund antilichaam gericht tegen het poliovirus; laan 6: geïnfecteerd celextract met 1/100 verdund antilichaam gericht tegen het TMEV; laan 7: niet-geïmmunoprecipiteerd niet-geïnfecteerd celextract zonder antilichaam.

3.3.3 Bespreking

• Laan 1: De immunoprecipitatie procedure werd hier uitgevoerd zonder toevoeging van MAb, hoewel men hier verschillende cellulaire proteïnenbanden kan waarnemen. Dit toont aan dat de cellulaire proteïnen aan de oppervlakteproteïnen van de bacterie binden in afwezigheid van het antilichaam. Daarom kan men hier spreken van aspecifieke binding
• In laan 2 tem laan 4 is de intensiteit van de verschillende banden vergelijkbaar, ondanks het feit dat hier wel Ab aanwezig is in verschillende concentraties. Indien het MAb door een kruisreactie het cellulaire proteïne zou binden, dan zou de intensiteit van de eiwitbanden moeten wijzigen in functie van de gebruikte concentratie MAb. Men zou bv. verwachten dat de intensiteit van de eiwitbanden groter is bij een hogere concentratie van het MAb, eerder dan bij een lagere concentratie aan MAb. Aangezien dit niet het geval is, kan hieruit geconcludeerd worden dat het MAb geen cellulaire proteïnen herkent en er dus geen kruisreactie met deze eiwitten optreedt.
• Laan 5: De immunoprecipitatie is hier uitgevoerd met een MAb gericht tegen het poliovirus. Ook hier vinden we dezelfde eiwitbanden terug als in langen 1 t.e.m. 4, zij het met een minderde intensiteit. Vermoedelijk is de aanwezigheid van de celluaire banden ook het gevolg van aspecifieke binding aan de oppervlakteproteïnen van de bacterie. De verklaring hiervoor is waarschijnlijk dat de antigenen in grote mate op de oppervlakteproteïnen van de bacterie -en in veel mindere mate aan het polioAb- binden.
• Laan 6 is de TMEV 160S controle. Hier zijn de drie banden van de virale proteïnen VP0, VP1 en VP3 duidelijk aanwezig.
• Laan 7 bevat niet-geïnfecteerd materiaal dat niet aan immunoprecipitatie onderworpen werd. Door het feit dat dit materiaal alle gemerkte proteïnen bevat is de radioactiviteit van deze laan te intens om individuele eiwitbanden te onderscheiden. Omdat dit monster niet belangrijk was om de gepaste conclusies te trekken, werd er geen nieuwe SDS-PAGE uitegevoerd met minder materiaal.