Subsections

4. Discussie

4.1 Aanmaak van radioactief referentiemateriaal

Wanneer TMEV 160S virionen gedurende 20 minuten bij 56^C worden verwarmd, vallen deze hoofdzakelijk uiteen in 14S afbraakpartikels. Op deze manier worden 14S partikels gemaakt die als referentie fungeren voor de 5-30% sucrose gradiënt ultracentrifugatie. Indien men daarentegen 160S virionen van het poliovirus aan dezelfde conditie onderwerpt, bekomt men 80S lege capsiden [28]. Hieruit kan men afleiden dat het TMEV gemakkelijker uiteenvalt, vergeleken met het poliovirus. Om na te gaan of er bij het TMEV ook 80S lege capsiden gevormd konden worden, werd de degradatietemperatuur verlaagd van 56^C naar 40^C. Het bleek dat er onder deze minder drastische omstandigheden geen TMEV 80S partikels konden worden waargenomen. Opvallend was wel dat er 1.4 keer meer 14S partikels gegenereerd werden bij 40^C in vergelijking met 56^C. Dit kon worden verklaard doordat 14S pentameren bij 56^C nog verder worden afgebroken tot 5S protomeren, terwijl dit veel minder het geval is bij 40^C. Een verlaging van de degradatietemperaturen van 56^C naar 40^C is dus minder destructief in termen van 14S partikels, maar levert geen 80S partikels op. Hieruit blijkt dat hoewel het TMEV en het poliovirus tot dezelfde familie behoren, ze andere karakteristieken hebben op het gebied van virale partikels. Anderzijds kan men, bij de aanmaak van 14S referentiemateriaal voor SGU, de virionen beter op 40^C verhitten omdat de hoeveelheid 14S afbraakmateriaal gegenereerd bij deze tempeartuur hoger is dan bij 56^C.

4.2 Invloed van de temperatuur op de morfogenese

Studie van de morfogenese bij 32^C, 34^C en 36^C

In deze studie werden er bij 34^C meer virionen gevormd dan bij 36^C en bij 32^C. Men verwacht dus dat de hoeveelheid 14S partikels bij 34^C groter is dan bij 36^C, omdat zij de precursoren van deze virionen zijn. Er werden echter meer 14S partikels bij 36^C dan bij 34^C en bij 32^C gevormd. Omdat deze 14S partikels enkel waarneembaar waren bij een lange pulstijd (19 uur), gaf dit een mogelijke indicatie dat het hier voornamelijk om 14S afbraakpartikels ging (die ontstaan na de maturatieklieving en dus voornamelijk uit VP1, VP2 en VP3 bestaan). SDS-PAGE bevestigde deze indicatie door aan te tonen dat deze virale proteïnen (VP1, VP2 en VP3) inderdaad in grote mate aanwezig waren.

Bij de kortere pulstijden was het niet mogelijk om precursorpartikels waar te nemen. Dit was onverwacht omdat er wel virionen gevormd werden en dus zouden er ook ergens precursorpartikels waarneembaar moeten zijn. Vermits dit niet het geval bleek te zijn, zou het kunnen dat deze precursorpartikels snel tot virionen geassembleerd worden, zodanig dat er geen duidelijke piek van 14S pentameren gevormd wordt.

Om een optimale virionproductie te verkrijgen, kan men in de toekomst de experimenten misschien beter bij 34^C, in plaats van bij de normale temperatuur van 37^C, uitvoeren vermits er bij 34^C meer virionen gevormd worden.

Studie van de morfogenese bij 30^C, 34^C en 37^C

Dit experiment werd uitgevoerd ter bevestiging van de resultaten uit het bovenstaande experiment en om vooralsnog precursorpartikels waar te nemen. Het is om die reden dat we behalve een extra pulstijd, ook de temperatuur van 37^C ingevoerd hebben.

Bij 34^C vindt men ook hier meer virionen dan bij een hogere temperatuur (37^C), maar dit verschil blijkt minder uitgesproken te zijn. Een mogelijke verklaring voor deze gedaalde opbrengst zou men kunnen toeschrijven aan de grotere hoeveelheid cellen gebruikt in dit experiment.

Bij 30^C werden er nergens virionen gevonden. Dit is in tegenstelling met een experiment waarbij Xenopus oöcyten geïnfecteerd door de GDVII-stam van het TMEV de grootste hoeveelheid precursormateriaal genereren bij een temperatuur van 30^C [20]. Deze -lage- temperatuur was noodzakelijk omdat de oöcyten in het andere geval niet zouden kunnen overleven. Hieruit volgt dat de temperatuur waarbij de experimenten uitgevoerd worden van cruciaal belang blijkt te zijn: is de temperatuur te laag, dan is er geen productie van virionen, maar is de productie te hoog, dan treedt er degradatie van de virionen op.

Er werden in dit experiment na een lange pulstijd echter evenveel 14S partikels gegenereerd bij 34^C als bij 37^C, terwijl er in het vorige experiment meer 14S partikels bij hogere temperatuur werden waargenomen. Een mogelijke verklaring voor dit fenomeen is dat de 14S partikels gevormd bij 37^C, sneller worden afgebroken naar 5S partikels dan bij 34^C (zie sectie 3.2.1).

Precursorpartikels werden nu wel beter waargenomen, althans de 5S protomeren. De 14S opbouwpentameren waren niet waarneembaar bij de pulstijden van 2 uur, 5 uur en 8 uur. Dit kan te wijten zijn aan een snellere omzetting van 14S pentameren naar virionen.

4.3 Nagaan van aspecifieke binding bij immunoprecipitatie

De cellulaire band die zichtbaar was na immunoprecipitatie van een niet-geïnfecteerd monster is niet het resultaat van een kruisreactie met het monoclonale anti-VP1 antilichaam, maar een gevolg van aspecifieke binding aan de oppervlakteproteïnen van de bacterie. Om dit probleem van aspecifieke binding te omzeilen, kan men in de toekomst misschien gebruik maken van proteïne A gekoppeld aan bv. sepharose of magnetic beads.



Nens 2005-02-20